深低溫凍存復蘇的外周血干細胞中ROS水平與歸巢粘附分子表達之間關系的研究.pdf

1、目的：
　　 造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSC)是干細胞的一種,其主要功能是通過不斷分化產(chǎn)生各系造血祖細胞,為血液系統(tǒng)提供新生細胞來源;同時又能自我更新維持自身數(shù)量不變,從而長期維持機體的正常造血機能,這種分化及我更新的能力是外周血干細胞移植(peripheralblood stem cell transplantation PBSCT)的生物學基礎。PBSCT是治療急性白血病和對化療治療敏感

2、的實體瘤有效的方法,它是利用化療和動員劑后外周血干細胞(peripheral blood stem cells,PBSC)-過性增高的機會進行采集、分離、低溫凍存PBSC,將其復蘇后回輸給患者以重建造血功能。在PBSCT過程中,凍存技術及PBSC凍存后的歸巢能力決定著PBSCT的成敗。
　　 HSC“歸巢”是指HSC隨血液循環(huán)最初出現(xiàn)在骨髓、脾、肝、甲狀腺等多個器官,而后特異性地停留在骨髓干細胞龕。研究表明造血干細胞歸巢的過程是

3、多步驟粘附及遷移的過程,目前多認為P-、E-選擇素,VLA-4及其配體血管細胞粘附分子-1(VCAM-1),CD44,基質細胞衍生因子-1(SDF-1)和其特異性受體CXCR4等在HSC歸巢中起關鍵作用。細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平過高發(fā)生氧化應激,可導致歸巢重要粘附分子P-selectin、VLA4、VLA5、CXCR4、CD44等表達異常,進而影響HSC的歸巢能力,ROS是指細胞利用氧進

4、行能量代謝的副產(chǎn)物,其主要包括超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等。本實驗通過檢測經(jīng)程控降溫液氮保存前后PBSC的ROS水平及歸巢分子的表達,分析二者之間的相關性,評價深低溫凍存、復蘇對外周血干細胞歸巢能力的影響及原因,為進一步改善冷凍保存及復蘇的條件,保護PBSC免于氧化應激損傷,維持其良好的生物學功能提供理論及實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、采集、冷凍保存及復蘇PBSC
　　 外周血干細胞來自中國醫(yī)科大學附屬

5、第一醫(yī)院血液科血液系統(tǒng)腫瘤患者,患者經(jīng)化療及重組人粒細胞集落刺激因子(rHu-GCF)動員后應用COBESpectra(GambroBCT,JSA)血細胞分離機應用PBSC分離程序采集外周血1～2次,得到含有PBSC的血液,進行常規(guī)臨床凍存時留取相關功能檢測樣本,經(jīng)功能檢測后廢棄樣本。將含有PBSC的血樣在無菌室超凈臺內(nèi)用Ficoll分離出PBSC后,分為實驗組及對照組,實驗組細胞中添加由自體血漿、ACD抗凝劑、二甲基亞砜(DMSO)按

6、7:2:1比例組成的冷凍保護劑,置HBL-96型程序降溫儀中進行降溫,達到-86℃保持10min后,取出冷凍標本,迅速置入-196℃液氮罐中凍存1、3、6、9、12個月后,取出標本放入37℃水浴箱中快速復蘇細胞。對照組細胞中不添加冷凍保護劑及經(jīng)程控降溫冷凍保存。
　　 二、觀察檢測指標
　　 分別觀察檢測復蘇的實驗組及對照組PBSC以下指標:用ABXMicros60血細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù);0.4%臺盼藍溶液測定PBSC

7、臺盼藍拒染率;37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)14天后在倒置顯微鏡下計數(shù)CFU-GM集落數(shù);流式細胞術檢測細胞內(nèi)ROS水平;流式檢測細胞表面抗原CD34、CD133以及歸巢相關分子VLA4、CXCR4、CD44的表達;研究ROS水平與歸巢分子的表達之間的相關性,評價凍存、復蘇PBSC過程中ROS水平對HSC功能,特別是歸巢功能相關粘附分子表達的影響。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,運用SPSS14.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),不同凍存時間的數(shù)據(jù)與凍存前數(shù)

8、據(jù)比較時采用方差分析,分析ROS水平與歸巢分子表達之間相關性時采用相關分析,P<0.05為差別具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.PBSC經(jīng)液氮深低溫保存后,臺盼藍拒染率隨凍存時間延長逐漸降低,PBSC凍存1個月的臺盼藍拒染率與凍存前比較無顯著性差異(P>0.05);凍存3、6、9、12個月與凍前比較具有統(tǒng)計學顯著性差異(P<0.05);冷凍保存半年后臺盼藍拒染率降至80%-90%,一年后的臺盼藍拒染率為70%左右

9、。
　　 2.冷凍保存的PBSC體外生成CFU-GM的能力不及冷凍保存前的標本,并隨凍存時間延長集落生成能力存在下降趨勢,凍存1、3、6個月與凍存前比較無顯著性差異(P>0.05),凍存9、12個月與凍前比較具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 3.PBSC經(jīng)液氮深低溫保存后,干細胞表面標志性抗原CD34、CD133及歸巢相關分子CD44、VLA4、CXCR4占淋巴細胞百分率隨凍存時間的延長有所下降,凍存1、3、6、9

10、個月與凍存前比較無顯著差異(P>0.05),冷凍保存一年后與凍存前相比具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 4.隨著冷凍保存時間的延長,細胞內(nèi)ROS水平逐漸升高,凍存1、3個月的外周血干細胞內(nèi)ROS水平與凍存前比較無顯著性差異(P>0.05),凍存6、9、12個月后細胞內(nèi)ROS水平與凍前比具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 5.PBSC內(nèi)ROS水平與細胞CD34+VLA4+、CD34+CXCR4+、CD34+CD4

11、4+雙陽性表達率之間的相關系數(shù)分別為-0.503、-0.457、-0.465(均P<0.05),ROS水平與歸巢分子的表達均呈負相關。除此之外,ROS與臺盼藍拒染率呈負相關關系,相關系數(shù)為-0.863(P<0.05),細胞內(nèi)ROS水平升高后導致細胞存活率降低。ROS與CFU-GM之間相關系數(shù)為-0.329(P>0.05),提示ROS與形成CFU-GM能力之間呈負相關關系,但相關關系并不密切。
　　 結論：
　　 1.外周