醫(yī)用臭氧的脊髓過氧化損傷作用及免疫調節(jié)的機制研究.pdf

1、研究背景:
　　 近年，醫(yī)用臭氧(ozone，O3)注射技術在疼痛臨床中均顯示了良好的應用前景。臭氧是氧分子的同素異形體，具有極強的氧化分解殺菌消毒能力。臭氧依靠與生物大分子反應生成的活性氧(ROS)和脂質過氧化產物(LOPs)產生治療作用，但ROS和LOPs一旦超出機體的抗氧化能力，則會導致機體的過氧化損傷。目前臭氧治療的濃度及劑量國內外尚未形成統(tǒng)一的標準。相關研究將不同濃度(30，50，80μg/ml)的醫(yī)用臭氧經小腦延髓池

2、注入兔蛛網膜下腔，結果表明鞘內注射較高濃度（50，80μg/ml）醫(yī)用臭氧對脊髓造成過氧化損傷作用，且損傷程度與臭氧濃度有量效關系;同時在較高濃度(40，60μg/ml)臭氧作用下星形膠質細胞細胞形態(tài)明顯受損，細胞膜通透性增加，表現在乳酸脫氫酶(LDH)漏出率增加、細胞內脂質過氧化產物丙二醛(MDA)水平升高。
　　 過氧化損傷是多因素、多環(huán)節(jié)的級聯過程，而細胞凋亡是導致神經細胞過氧化損傷的主要機制之一。凋亡是多基因嚴格控制的過

3、程。凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2及二者的比例對細胞的生存和死亡具有重要的調控作用。脊髓損傷后，電鏡下可觀察到枕葉皮質線粒體及內質網腫脹呈空泡樣，脊髓呈現神經結構性損傷及Bcl-2，Bax的表達變化。細胞凋亡具有獨特而復雜的信號系統(tǒng)，其發(fā)生過程的啟動和進行受到精確調控，其中JNK/MAPK通路可被炎癥、應激和損傷啟動的信號激活并介導細胞凋亡信號的轉導，激活的JNK通路可調控凋亡相關基因家族成員的差異性表達:如Bax的表達上調和Bc

4、l-2的表達下調。
　　 機體在受到外界傷害性刺激時，會自發(fā)進行保護性免疫應答。氧化應激所激活的脂質過氧化反應可進一步活化機體免疫反應的發(fā)生。Toll樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)在針對病原體入侵的防守中發(fā)揮重要作用，能夠特異性識別病原相關的分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，不僅可以激活固有免疫，而且可以調節(jié)獲得性免疫。作為脂多糖LPS

5、（lipopolysaccharide）的主要識別受體，Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)可進一步識別LPS激活靶細胞誘導產生的炎性因子（如TNF-α、IL-6等）。TLRs的適當激活有利于機體抵抗過氧化損傷，過度激活所引起的持續(xù)性免疫反應也會給機體帶來不利影響，在LPS持續(xù)刺激下TLR4可介導敗血病和感染性休克的發(fā)生，因此TLRs的激活必須受到嚴密的負向調控，以保持機體免疫的相對穩(wěn)定。
　　

6、泛素化過程是蛋白質翻譯后修飾(post-translational modifications，PTM)的一種形式，調節(jié)多種細胞生物學過程。泛素化作用是細胞內存在的負向調控因子抑制或終止信號蛋白表達的主要機制之一。泛素化經泛素標記后的蛋白質經特異性識別后降解，在細胞的抗原呈遞及炎癥反應等占有重要地位，其中泛素連接酶E3(ubiquitin-protein ligase E3)在泛素化修飾中具有中心作用。有研究表明，WW結構域的E3泛素蛋

7、白連接酶1 WWP1(WW domain containing E3 ubiquitinprotein ligase1)可能參與機體炎癥反應的過程，炎性因子TNF-α可誘導WWP1的產生。同時，LPS-TLR4介導的炎性反應能夠誘導機體的固有免疫反應，而WWP1通過拮抗DAF-2胰島素信號轉導通路進而調節(jié)機體的固有免疫。轉化生長因子TGF-β（transforming growth factorβ）可誘導WWP1的表達水平升高，可能與W

8、WP1抑制TGF-β的負反饋調節(jié)作用有關;而TGF-β所介導的抗炎反與LPS-TLR4所介導的炎性反應之間的平衡在機體許多炎性疾病中發(fā)揮了重要作用。經研究證實TLR4受體的表達受TGF-β的調控，但WWP1是否參與TLR4受體表達的負向調控尚無有關研究。
　　 醫(yī)用臭氧可導致脊髓過氧化損傷，其損傷機制與神經細胞凋亡有關，而MAPK信號通路是導致細胞凋亡發(fā)生的重要通路之一。目前WWP1參與機體炎性反應的機制研究尚少，是否與機體免疫

9、應答的負向調控有關有待進一步闡明。
　　 目的:
　　 本研究通過體外和體內實驗觀察不同濃度(20，40，60μg/ml)醫(yī)用臭氧對神經細胞和脊髓組織JNK/MAPK信號轉導通路的影響，著重從細胞凋亡角度探討JNK/MAPK信號轉導通路在醫(yī)用臭氧的脊髓毒性作用機制的可能影響;通過觀察WWP1的過度表達或沉默對LPS所誘導的各通路蛋白和炎性因子表達的影響，著重從Toll樣受體泛素化角度探討WWP1對LPS-TLR4所介導的

10、MyD88信號依賴通路的可能調節(jié)機制。
　　 方法:
　　 1.觀察不同濃度（20，40，60μg/ml）醫(yī)用臭氧對神經細胞的細胞損傷作用
　　 原代大鼠脊髓神經元細胞進行MAP-2免疫熒光鑒定后觀察不同濃度臭氧干預下細胞形態(tài)學的改變Hoechst33258熒光染色法觀察細胞和損傷。全細胞膜片鉗觀察低濃度(15，20μg/ml)臭氧對神經元鈣電流的影響。MTT和流式細胞技術檢測脊髓神經元和PC12的細胞活力。RT

11、-PCR和Western blotting法檢測細胞內Bax和Bcl-2的表達。
　　 2.不同濃度醫(yī)用臭氧作用下神經細胞MAPK信號轉導通路的表達變化
　　 Western blotting法檢測不同濃度臭氧（20，40，60μg/ml）作用24h后神經細胞內JNK，p-JNK，ERK和p-ERK的表達。
　　 3.JNK抑制劑對不同濃度醫(yī)用臭氧誘導神經細胞凋亡的影響
　　 神經細胞加入JNK特異性抑制

12、劑AS601245(0.1μM)預處理40min，分別進行20，40，60μg/ml臭氧干預。Western blotting檢測JNK和p-JNK蛋白水平表達的變化，MTT和流式細胞技術檢測神經細胞活力，RT-PCR和Western blotting檢測細胞內Bax和Bcl-2的表達。
　　 4.大鼠鞘內注射模型的建立，觀察不同濃度（20，40，60μg/ml）醫(yī)用臭氧干預后大鼠脊髓組織細胞凋亡的程度及JNK/MAPK信號轉導

13、通路的表達變化。
　　 不同濃度臭氧干預24h后，采用BBB評分進行動物神經行為學評價。RT-PCR和Western blotting法檢測凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達;Westernblotting法檢測JNK和ERK蛋白的表達。
　　 尾靜脈給予AS601245(4.5mg/kg)6h后鞘內注射不同濃度臭氧，注射24h后對大鼠后肢運動功能進行評價，并分別檢測大鼠脊髓組織中Bax、 Bcl-2、JNK、p

14、-JNK、ERK及p-ERK的表達。
　　 5.觀察WWP1對LPS或TNF-α所誘導的炎性反應的影響
　　 通過SiRNA干擾/質粒轉染技術使腹腔巨噬/RAW264.7細胞內WWP1沉默或過度表達（野生型和突變型），ELISA和RT-PCR檢測LPS或TNF-α刺激下細胞中TNF-α和IL-6的分泌和表達，Western blotting檢測IRF3、NF-κB和MAPK各通路(JNK、ERK、P38)的蛋白表達。

15、r>　　 6.研究WWP1對LPS-TLR4激活的MyD88信號依賴通路的可能作用位點
　　 采用質粒轉染技術將已標記的TRAF6和IRAK1分別與WWP1轉染HEK293T細胞后，免疫共沉淀技術檢測WWP1分別與TRAF6和IRAK1的相關性。Western blotting法檢測WWP1作用下TRAF6和ITAK1的蛋白表達變化，加入蛋白酶抑制劑MG132后檢測TRAF6的蛋白表達變化。
　　 通過SiRNA干擾/

16、質粒轉染技術使腹腔巨噬/RAW264.7細胞內WWP1沉默或過度表達（野生型和突變型），Western blotting檢測TRAF6和ITAK1的表達及LPS刺激下TRAF6的泛素化與K48或K63聚泛素化的關系。
　　 7.體內實驗進一步觀察WWP1沉默對LPS所誘導的小鼠肺損傷的保護作用
　　 采用SiRNA干擾技術使小鼠體內WWP1沉默后，通過LPS刺激建立內毒素休克模型，ELISA法測定小鼠血清中TNF-α和I

17、L-6的分泌，肺組織化學染色法觀察小鼠肺組織的損傷程度。
　　 結果:
　　 1.不同濃度醫(yī)用臭氧的脊髓毒性作用及機制的體外研究
　　 不同濃度（20，40，60μg/ml）臭氧作用后光鏡下可見神經細胞內大皰形成，神經突起扭曲斷裂，Hoechst33258染核后，細胞核高亮濃縮，出現核碎裂及核固縮，該效應與臭氧濃度呈正相關。與對照組相比，較低濃度臭氧(15，20μg/ml)可使神經細胞鈣內流增加(P＜0.05)，

18、激活電壓向超極化方向移動(P＜0.05);三組鈣電流穩(wěn)態(tài)失活曲線均無顯著性差異（P＞0.05）。與對照組及較低濃度臭氧20μg/ml組相比，60μg/ml臭氧組能夠顯著抑制神經細胞的存活率(P＜0.01);與對照組相比，40μg/ml臭氧組可觀察到大量凋亡的神經細胞。RT-PCR和Westernblotting結果均顯示各臭氧組較對照組神經細胞內凋亡蛋白Bax表達明顯升高(60μg/ml，P＜0.01)，且具有濃度依賴性，但抗凋亡蛋白B

19、cl-2表達無明顯差異（P＞0.05）。各臭氧組磷酸化JNK蛋白表達與Bax表達水平具有類似趨勢(60μg/ml，P＜0.01)，AS601245預處理后可明顯抑制較高濃度(40μg/mlO3)臭氧所誘導的細胞凋亡(P＜0.05)，顯著降低磷酸化JNK和Bax蛋白的表達水平（P＜0.01）。
　　 2.不同濃度醫(yī)用臭氧的脊髓毒性作用及機制的體內研究
　　 與對照組相比，鞘內注射不同濃度(20，40，60μg/ml)臭氧后

20、，較高濃度(40，60μg/ml)臭氧組注射后BBB評分與對照組相比明顯降低，且60μg/ml臭氧組脊髓損傷更明顯（P＜0.01）;凋亡蛋白Bax的表達水平隨著臭氧干預濃度的增加而升高(P＜0.01);抗凋亡蛋白Bcl-2表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。Westem blotting結果顯示p-JNK/MAPK活力隨著臭氧濃度升高而明顯增加（60μg/ml，P＜0.01），尾靜脈給予AS601245預處理后，各臭氧組大鼠BBB評分均有

21、所改善(P＜0.05)，各組p-JNK/MAPK活力明顯降低(P＜0.01)，較高濃度臭氧組（40μg/ml）Bax的表達水平明顯降低(P＜0.01)。
　　 3.WWP1明顯抑制LPS而非TNF-α刺激下TNF-α和IL-6的表達
　　 Lesh WWP1+LPS組的腹腔巨噬細胞TNF-α和IL-6的表達水平明顯增加(P＜0.01)，而Lesh NC各組及Lesh WWP1+TNF-α組未見明顯差異(P＞0.05);H

22、is-WWP1+LPS組的RAW264.7細胞TNF-α和IL-6的表達水平明顯降低（P＜0.01），而His-Control各組及His-WWP1+TNF-α組及His-C890A各組無明顯變化(P＞0.05);與Lesh NC+LPS組相比，Lesh WWP1+LPS組小鼠血清中TNF-α和IL-6的表達均增加(P＜0.01);同時Lesh WWP1+LPS組小鼠的肺組織學分析呈現出更為嚴重的肺損傷。
　　 4.WWP1抑制

23、LPS誘導下IκB-α，NF-κB及MAPK的活化，而與IRF3的表達無關
　　 與Lesh NC組相比，Lesh WWP1組中p-IκB-α、p-65、p-JNK、p-ERK、p-P38活力明顯增加，以LPS刺激后90 min增加最明顯，而IRF3的表達無明顯統(tǒng)計學差異;與His-Control組及His-C890A組相比，His-WWP1組中p-IκB-α、p-65、p-JNK、p-ERK、p-P38活力明顯降低，而對IRF

24、3的表達無明顯影響。
　　 5.WWP1對TRAF6而非IRAK1具有明顯的蛋白酶體降解作用
　　 His-WWP1與Myc-TRAF6組出現蛋白共沉淀現象，而與IRAK1無關;His-WWP1和His-C890A兩組均與myc-TRAF6出現免疫共沉淀現象;LPS刺激后(30，60 min)出現WWP1與TRAF免疫共沉淀現象;Myc-TRAF6+His-WWP1組中TRAF6的蛋白表達明顯降低，而WWP1野生型對TR

25、AF6的降解作用可被MG132緩解，myc-TRAF6+His-C890A組中TRAF6的蛋白表達無明顯變化;與Lesh NC組相比，Lesh WWP1組TRAF6的蛋白表達明顯增加，且LPS刺激120min后更明顯;Myc-TRAF6+His-WWP1組中TRAF6的蛋白表達明顯降低，而His-C890A組TRAF6表達無明顯變化。
　　 6.WWP1基因的沉默降低LPS誘導下TRAF6的K48而非K63相關的泛素化
　

26、　 Lesh NC組TRAF6在LPS刺激下均發(fā)生K48及K63相關的泛素化，而LeshWWP1組細胞中TRAF6在LPS刺激60 min后只發(fā)生K48相關的泛素化。
　　 結論:
　　 1.醫(yī)用臭氧對神經細胞具有過氧化損傷作用，較高濃度臭氧(40，60μg/ml)可降低神經細胞的存活率，誘導細胞鈣離子內流增加，增加凋亡蛋白Bax的表達;鞘內注射臭氧可明顯降低大鼠后肢運動功能評分，使脊髓組織中的Bax蛋白過度表達，且具

27、有濃度依賴性。
　　 2.較高濃度臭氧(40，60μg/ml)干預后可增加神經細胞和脊髓組織的磷酸化JNK蛋白水平，JNK抑制劑預處理后可明顯降低臭氧引起的神經系統(tǒng)的過氧化損傷，降低細胞凋亡率，改善運動功能評分。
　　 3.醫(yī)用臭氧通過JNK/MAPK信號轉導通路調節(jié)Bax蛋白的表達介導脊髓神經系統(tǒng)過氧化損傷。
　　 4.WWP1對LPS所誘導的炎性因子TNF-α和IL-6的表達具有抑制作用。
　　 5.