擬穴青蟹SpALF6和SpALF7的克隆、表達及功能研究.pdf

1、抗脂多糖因子（Anti-lipopolysaccharide factor,ALF）是甲殼動物體內主要的抗菌肽分子，屬于陽離子抗菌肽家族。該家族抗菌肽具有序列和功能多樣性的特點，在抗細菌、真菌、病毒等免疫反應中發(fā)揮重要作用。目前，對于該類抗菌肽如何通過序列的多樣性影響其功能的多樣性，仍缺乏足夠的了解。本研究論文從擬穴青蟹體內鑒定了2種非典型的抗脂多糖因子成員，通過序列分析和功能研究，初步闡明了ALF家族成員序列多樣性和其免疫功能的關系，

2、揭示了序列多樣性對功能多樣的性的影響規(guī)律。
　　我們研究首先從擬穴青蟹體內鑒定了SpALF6及其變異體SpALF6-V。與該家族大多成員蛋白屬于陽離子抗菌肽不同，SpALF6的pI值為6.79，其LPS結合結構域LBD（LPS-binding domain）pI值為6.05，屬于非典型的ALF家族成員，而其自然界中變異體SpALF6-V的pI值卻為7.98，屬于陽離子抗菌肽。生物信息學分析發(fā)現，這個變異體的產生是源于特定位點單核苷

3、酸多態(tài)性（SNP）。為了研究SNP位點的存在對蛋白質功能的影響，我們對這兩個蛋白質進行生物信息學分析，發(fā)現這兩個氨基酸的突變分別是SpALF6成熟肽的LBD附近帶正電荷組氨酸突變成高電荷精氨酸（H46突變?yōu)镽），遠離LBD的丙氨酸突變成了脯氨酸（A110突變?yōu)镻）。由于丙氨酸和脯氨酸都不帶電荷，而且遠離LPS結合域，因此我們認為突變體SpALF6-V與SpALF6的性質功能上的差異可能是由組氨酸的突變導致的，因此為了研究這兩種抗菌肽功能

4、上的差異，我們通過人工定點突變的技術僅將組氨酸突變成了精氨酸獲得了SpALF6的人工突變體來模擬SpALF6-V的功能，命名為SpALF6-M。首先我們進行了SpALF6在體內組織分布和表達模式研究。隨后我們進行了SpALF6、SpALF6-M體外抑菌實驗，細菌結合實驗以及微生物表面主要病原相關分子模式結合實驗比較研究。此外，我們也人工合成了SpALF6的LBD肽對其保守區(qū)進行了抑菌活性和微生物表面多糖結合研究。組織分布和表達模式研究結

5、果表明，SpALF6主要是在血淋巴中表達，副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌免疫刺激青蟹后可以導致SpALF6的上調表達，暗示SpALF6可能參與到了抑菌免疫應答。與SpALF6相比，SpALF6-M表現出了更強抗革蘭氏陽性菌和真菌作用以及細菌結合活性。同時，SpALF6-M也表現出了更強的LTA的結合活性，暗示SpAFL6-LBD外部且距離該結構域較近的特定氨基酸的能協(xié)助增強蛋白的抗菌作用。SpAFL6-LBD肽的功能研究結果表明，SpAFL

6、6-LBD肽可以結合LPS、LTA、PGN等多糖，而且活性更強，表明該保守區(qū)域仍是活性中心，但是該陰離子短肽并沒有表現出抑菌作用，暗示著其發(fā)揮抑菌作用仍需要LBD附近的氨基酸參與。
　　我們研究還鑒定了SpALF7，通過生物信息學分析發(fā)現，與經典的ALF蛋白家族具有3個α-螺旋和4個β-折疊，并且依靠2個半胱氨酸形成1個二硫鍵維持核心功能域的三維結構不同，蛋白序列及結構預測顯示，SpALF7只含有2個α-螺旋和4個β-折疊，并且該

7、序列含有4個半胱氨酸，可能形成2個二硫鍵。對其組織分布和抗菌功能進行研究，發(fā)現SpALF7主要表達在血細胞；重組蛋白SpALF7體外抑菌功能研究發(fā)現SpALF7對除嗜水氣單孢菌以外革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌以及真菌生長都有不同程度的抑制作用。SpALF7的細菌結合實驗結果表明，SpALF7與副溶血弧菌、酵母菌和氣單胞菌結合活性較強，而與金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠球菌結合活性較弱。微生物多糖結合實驗顯示，SpALF7可結合LP

8、S，對金黃色葡萄球菌PGN、LTA和真核生物細胞壁組分β-葡聚糖也有一定的結合活性，暗示SpALF7的抗菌功能與其糖結合能力密切相關，可能利用與特定糖組分的結合，促進隨后的抑菌功能。
　　通過上述研究，本論文明確了SpALF6和SpALF7在青蟹免疫體系中發(fā)揮重要作用，闡明了兩個抗菌肽的主要序列特征、抗菌特性及可能的抗菌機理，進一步揭示了ALF類分子抗菌活性與序列多態(tài)性之間的關系，具有重要的理論價值。此外，本研究還發(fā)現SpALF6