肝損傷大鼠血清對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的影響.pdf

1、目的:
　　尋找分離、擴(kuò)增、鑒定臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)的方法，探討肝損傷大鼠血清對hUCMSCs的肝向誘導(dǎo)分化作用，為臨床上利用hUCMSCs治療終末期肝病患者提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.采用酶消化法分離培養(yǎng)hUCMSCs，在顯微鏡下觀察提取的臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記CD73、CD105及造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34、CD45的表達(dá)。
　　3.使

2、用成脂誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化23天后用油紅O染色，成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化21天后用茜素紅染色。
　　4.建立急性肝損傷大鼠模型:模型組腹腔注射四氯化碳-大豆油溶液，對照組腹腔注射等劑量的大豆油，48小時(shí)后腹主動(dòng)脈取血，檢測大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，取大鼠肝組織進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察這兩組大鼠肝臟病理學(xué)變化。
　　5.分別將肝損傷大鼠血清和胎牛血清用于培養(yǎng)hUCMSCs，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組:20％模型

3、組大鼠血清配成的培養(yǎng)基培養(yǎng)hUCMSCs，對照組:20％胎牛血清配成的培養(yǎng)基培養(yǎng)hUCMSCs。觀察誘導(dǎo)前、實(shí)驗(yàn)組及對照組培養(yǎng)后hUCMSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，檢測培養(yǎng)液上清AFP、ALB值變化。
　　結(jié)果:
　　1.倒置顯微鏡下可見原代hUCMSCs貼壁生長，呈短梭形，6-7天后生長速度加快，細(xì)胞呈梭形，表現(xiàn)為編織狀或旋渦狀生長。
　　2.經(jīng)流式鑒定發(fā)現(xiàn)hUCMSCs表達(dá)CD73、CD105等間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記，不表達(dá)C

4、D34、CD45等造血細(xì)胞標(biāo)記。
　　3.P3代hUCMSCs成脂定向誘導(dǎo)23天后，未加成脂誘導(dǎo)劑的對照組細(xì)胞油紅O染色陰性，加入成脂誘導(dǎo)劑的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞油紅O染色強(qiáng)陽性，大部分細(xì)胞中可見紅色的脂肪空泡。P3代hUCMSCs成骨定向誘導(dǎo)21天后，未加成骨誘導(dǎo)劑的對照組茜素紅染色陰性，加入成骨誘導(dǎo)劑的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞茜素紅染色陽性，可見細(xì)胞間有黑色顆粒沉積，顆粒大小不等，形態(tài)不一，提示有黑色礦物質(zhì)沉積。
　　4.四氯化碳模型組大鼠血清

5、與對照組相比，ALT、AST升高明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。模型組大鼠肝組織光鏡下可見肝竇結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞脂肪變性、灶狀壞死，細(xì)胞核固縮、碎裂或溶解，肝細(xì)胞間及匯管區(qū)可見少量炎性細(xì)胞浸潤。對照組光鏡下見肝組織結(jié)構(gòu)清晰，無細(xì)胞水腫、變性及壞死，無炎性細(xì)胞浸潤。
　　5.肝損傷大鼠血清培養(yǎng)hUCMSCs第1天細(xì)胞形態(tài)變化不大，呈梭形，仍呈編織狀或旋渦狀生長。第2天細(xì)胞呈短梭形，第3天細(xì)胞呈類圓形，第4天呈圓形，并有極少量

6、細(xì)胞漂浮。對照組細(xì)胞呈長纖維狀。肝損傷大鼠血清培養(yǎng)hUCMSCs四天后檢測上清液ALB發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組ALB較誘導(dǎo)前和對照組均有升高趨勢(P＜0.001)，AFP無明顯變化。
　　結(jié)論:
　　1.可從臍帶組織中成功提取間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2.提取的干細(xì)胞能貼壁生長，可表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記CD73、CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34、CD45，具有向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞分化的潛能。
　　3.10％四氯化碳-大豆油溶液腹