團(tuán)頭魴phds基因家族參與低氧應(yīng)答的分子機(jī)理解析.pdf

1、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）作為我國重要淡水養(yǎng)殖魚類，目前面臨著種質(zhì)資源退化以及養(yǎng)殖環(huán)境惡化的問題。和四大家魚相比團(tuán)頭魴缺氧耐受能力差，導(dǎo)致其很難適應(yīng)急劇惡化的養(yǎng)殖環(huán)境，尤其是缺氧環(huán)境。另外，團(tuán)頭魴自身性情暴躁、容易受驚，極易對不良環(huán)境產(chǎn)生應(yīng)激。上述因素極大制約了團(tuán)頭魴養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。因此本研究對不同溶氧濃度及處理時間條件下團(tuán)頭魴行為學(xué)、生理生化、非特異性免疫相關(guān)指標(biāo)和環(huán)境應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行了分析;同時

2、獲得了prolylhydroxylases(phd)家族3個基因phd1、phd2和phd3序列，并對phds進(jìn)行生物信息學(xué)、時空表達(dá)及甲基化水平等分析，為耐低氧團(tuán)頭魴品種/品系的培育提供一定的理論基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果如下:
　　1.低氧處理前后團(tuán)頭魴行為學(xué)變化
　　低氧處理后團(tuán)頭魴呼吸頻率從常氧條件下的平均182次/min增加到平均245次/min，并且魚嘴張合幅度增加，團(tuán)頭魴也從水體底部和中部游到上層水體進(jìn)行水面呼吸(A

3、quatic surface respiration，ASR)。當(dāng)水體溶氧水平繼續(xù)下降并且接近團(tuán)頭魴窒息點(diǎn)溶氧0.5 mg/L時，團(tuán)頭魴身體失去平衡。復(fù)氧處理后團(tuán)頭魴上述行為也逐漸恢復(fù)到正常狀態(tài)。整體上低氧處理后團(tuán)頭魴自發(fā)性活動頻率增加。
　　2.低氧處理前后團(tuán)頭魴生理生化指標(biāo)變化
　　團(tuán)頭魴血紅蛋白、高鐵血紅蛋白、血糖、Na+、琥珀酸脫氫酶和乳酸水平在不同溶氧(dissolved oxygen，DO)濃度包括對照(DO:5

4、.5 mg/L)以及急性低氧(DO:3.5和1.0 mg/L)處理后，隨著溶氧濃度的下降而逐漸升高，肝糖原水平逐漸下降。
　　團(tuán)頭魴血紅蛋白、高鐵血紅蛋白、血糖和乳酸含量隨著低氧時間(0.5h和6 h DO:3.5 mg/L)延長而升高，Na+和肝糖原水平下降，琥珀酸脫氫酶含量不變。復(fù)氧后上述7項(xiàng)指標(biāo)水平全部下降。
　　3.低氧處理前后團(tuán)頭魴非特異性免疫指標(biāo)變化
　　團(tuán)頭魴干擾素alpha和溶菌酶水平隨著溶氧濃度的下降

5、而逐漸升高，而白蛋白水平則逐漸下降。另外，隨著低氧時間的延長團(tuán)頭魴干擾素alpha水平升高，而白蛋白和溶菌酶水平則降低。復(fù)氧后上述3項(xiàng)指標(biāo)水平全部升高。
　　4.低氧處理前后團(tuán)頭魴環(huán)境應(yīng)答蛋白的表達(dá)變化
　　Western blot分析顯示Heat shock protein70(Hsp70)在團(tuán)頭魴組織中表達(dá)兩條帶，其中較小的Hsp70條帶通過hsp70內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)翻譯。較大Hsp70在團(tuán)頭魴肝臟、脾臟、腦、鰓和腎臟

6、中檢測到表達(dá)，而較小Hsp70僅在肝臟、脾臟和鰓中檢測到表達(dá)。Hypoxia-inducible factor1alphs(Hif-1α)在團(tuán)頭魴肝臟、脾臟和鰓中的蛋白水平隨著溶氧濃度下降以及低氧處理時間的增加而升高。
　　5.團(tuán)頭魴phds基因cDNA和啟動子擴(kuò)增及序列特征
　　作者設(shè)計開發(fā)了基于生物信息學(xué)和多重PCR技術(shù)的高效cDNA和啟動子擴(kuò)增方案，獲得了團(tuán)頭魴phd1、phd2和phd3的cDNA全長和啟動子序列，該

7、方法也在其他魚蝦中進(jìn)行了有效性驗(yàn)證。
　　生物信息學(xué)分析顯示3個phds基因均包含5個外顯子(exons)，編碼的氨基酸序列都含有脯氨酸羥基化酶結(jié)構(gòu)域P4He，該區(qū)域中包含3個鐵離子結(jié)合位點(diǎn)（氨基酸H、D和H殘基），而Phd2的N末端還有一個zf-MYND結(jié)構(gòu)域。啟動子分析顯示Phd1和phd3啟動子中都包含低氧應(yīng)答元件(hypoxia response element，HRE)結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶活性進(jìn)一步分析顯示phd3啟動子

8、中5個HRE位點(diǎn)對Hif-1α做出應(yīng)答，其中HRE1、HRE2和HRE3應(yīng)答活性較強(qiáng)。
　　6.團(tuán)頭魴phds的表達(dá)分析
　　時空表達(dá)譜分析顯示團(tuán)頭魴phd1在胚胎發(fā)育過程中的眼囊期表達(dá)量最高;常氧條件下該基因在血液、腦和心臟中表達(dá)較高，但低氧處理后，其在血液、肌肉、腦、心臟和腸表達(dá)下降，在鰓表達(dá)升高。另外，作者也發(fā)現(xiàn)phd1可以通過選擇不同的起始密碼子而表達(dá)出兩種蛋白，并且兩種蛋白都位于細(xì)胞核中，其中較大蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞增

9、殖。
　　團(tuán)頭魴phd2在16-細(xì)胞期、囊胚早期和囊胚中期表達(dá)量較高;常氧條件下該基因在肌肉和鰓表達(dá)最高，低氧處理后其在血液、肝臟、脾臟、肌肉和心臟中的表達(dá)量下降。
　　而團(tuán)頭魴phd3在胚胎發(fā)育的早期表達(dá);常氧條件下該基因在肝臟表達(dá)最高，而低氧后其在所檢測的9個組織中都上調(diào)表達(dá)。另外，作者也發(fā)現(xiàn)phd3存在兩種不同的選擇性剪接體，并且這兩個剪接體都可被低氧誘導(dǎo)表達(dá)。
　　7.TDN-PCR分析團(tuán)頭魴phds甲基化水平

10、
　　團(tuán)頭魴phdl在低氧敏感和耐受個體的肌肉組織中表達(dá)差異不顯著，phd2在低氧敏感和耐受個體肌肉組織表達(dá)差異顯著，而phd3在低氧耐受個體中表達(dá)量較高，在低氧敏感個體中幾乎檢測不到表達(dá)。為了分析候選基因啟動子的甲基化對基因表達(dá)的影響，作者設(shè)計開發(fā)了特異性和靈敏性較高的Touch-down based nest-PCR(TDN-PCR)用于DNA甲基化分析，結(jié)果表明團(tuán)頭魴低氧敏感和耐受個體的phd2和phd3啟動子上CpG區(qū)域沒

11、有甲基化，而phd1啟動子上有2個甲基化區(qū)域。
　　為了進(jìn)一步在團(tuán)頭魴低氧敏感和耐受群體中分析phd1啟動子區(qū)域的甲基化水平，作者利用TDN-PCR技術(shù)的高分辨率溶解曲線(high-resolution melting，HRM)方法對其進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示團(tuán)頭魴phd1啟動子高甲基化程度與低氧敏感群體顯著正相關(guān)。
　　8.TDN-PCR分析魚類phd1甲基化水平
　　通過TDN-PCR擴(kuò)增來自鯉形目、鱸形目和鱧形目的幾