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文檔簡介
1、人Sema4C基因是從人胎腦中克隆分離出的一個Ⅳ型跨膜Semaphorin家族新成員,這個基因由13個外顯子組成,染色體定位于2q11.2,該基因編碼833個氨基酸,分子量約為92.6kD,為單次跨膜蛋白。本研究主要圍繞Sema4C基因的亞細胞定位、組織表達、生物學功能及其作用機理展開系統(tǒng)研究。 本研究首先通過缺失體研究表明,Sema4C分子的胞外段(包括Sema,結構域和PSI結構域)的完整性是Sema4C蛋白進行適當?shù)姆g后
2、修飾和亞細胞定位所必需的。原位雜交和免疫組化的結果表明,Sema4C基因在E11.5小鼠胚胎的前腦、眼原基、背根神經節(jié)和動脈弓中均有表達;E13.5小鼠胚胎除以上部位以外在上肢肢芽中也有部分表達。在成年小鼠的大腦皮層、小腦蒲肯野纖維層、視網(wǎng)膜視神經節(jié)細胞層和腎小管上皮細胞層中Sema4C均有較高表達,而在肌肉、心臟、肺、脾和肝臟等組織中表達量比較低或未檢測到表達。以上結果提示我們,Sema4C不僅在神經發(fā)育過程中發(fā)揮經典作用,而且可能在
3、神經系統(tǒng)之外的其他組織諸如骨骼肌發(fā)育過程中也可能擔當著某種角色。 為驗證Sema4C是否在骨骼肌發(fā)育和成肌分化過程中發(fā)揮作用,我們首先進行了成肌細胞體外誘導分化培養(yǎng),并建立了在體大鼠骨骼肌損傷修復的動物模型,利用RT-PCR和Western blot的方法分別在mRNA和蛋白水平檢測了Sema4C在體內外成肌、分化過程中的表達規(guī)律。結果表明,Sema4C在體內外成肌細胞誘導分化過程中其表達都顯著上調。為了深入研究Sema4C對成
4、肌細胞C2C12增殖分化的影響,分別構建了人Sema4C基因的真核表達質粒和重組Ad5-Sema4C腺病毒載體用于穩(wěn)定和瞬時過表達外源性人Sema4C基因。研究顯示,穩(wěn)定轉染和瞬時過表達Sema4C基因都能明顯促進細胞的終末分化,肌肉分化特異分子肌球蛋白和肌酸激酶等表達上調;成肌轉錄因子myogenin的表達增強。而通過RNAi方法特異性降低Sema4C基因的表達則能顯著抑制C2C12細胞的終末成肌分化,并降低肌球蛋白myosin和成肌
5、轉錄因子myogenin的表達。 在研究過程中,還發(fā)現(xiàn)在C2C12中過表達Sema4C能特異性地引起p38 MAPK的磷酸化,而MAPK信號通路中ERK1/2和JNK的磷酸化水平不受影響;p38特異性化學抑制劑SB203580能夠阻斷Sema4C在成肌分化中的促分化效應。此外,在C2C12成肌細胞分化過程中通過siRNA轉染的方法特異性降低Sema4C基因的表達,伴隨著肌管融合的減少,p38的磷酸化也明顯受到抑制。我們通過雙熒光
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