抑癌基因KLF6的克隆及質粒構建并轉染膀胱癌BIU-87細胞的研究.pdf

1、目的：
　　構建可進行細胞轉染的pEGFP-C1-KLF6質粒載體并轉染膀胱癌BIU-87細胞，并研究其轉染情況，有助于后續(xù)實驗的進行，同時可為膀胱癌的基因治療提供新的選擇。
　　方法：
　　1、目的基因的獲取及質粒的構建：提取RNA并設計KLF6的引物序列，RT-PCR克隆目的基因，BamH I和EcoR I雙酶切KLF6和質粒載體pEGFP-C1后進行連接反應，構建含有目的基因KLF6的重組質粒pEGFP-C1-K

2、LF6；
　　2、質粒擴增及轉染：對重組pEGFP-C1-KLF6質粒進行擴增，以達到實驗所需要的數(shù)量并進行純化。采用陽離子脂質體介導將含或不含 KLF6的質粒轉染入BIU-87細胞，分別作為轉染組和空載體組，對照組選用未轉染的 BIU-87細胞；
　　3、RT-PCR和Western檢測轉染后KLF6 mRNA和蛋白的表達水平。
　　結果：
　　1、成功獲得目的基因并構建pEGFP-C1-KLF6質粒，使其可進

3、行細胞轉染和實驗使用。
　　2、重組質粒經(jīng)過擴增、抽提并純化，經(jīng)電泳檢驗與擴增前重組pEGFP-C1-KLF6質粒位置一樣。
　　3、實驗的對照組及空載體組在熒光顯微鏡下觀察未見熒光，轉染組在熒光顯微鏡下可見60％左右細胞內(nèi)具有綠色熒光。
　　4、RT-PCR和Western實驗均可檢測到轉染組KLF6 mRNA和蛋白的表達，而對照組和空載體組則未見明顯表達。
　　結論：
　　1、構建成功的pEGFP-C1