胎兔皮膚無瘢痕愈合相關蛋白的初步篩選與分析.pdf

1、背景和目的：瘢痕愈合是創(chuàng)傷修復的主要方式，其結果是：一方面，瘢痕的形成可以覆蓋創(chuàng)面，增加創(chuàng)面強度；另一方面，瘢痕的增生影響表形美觀，甚至影響機體局部功能和患者的心理健康。研究發(fā)現(xiàn)許多種系動物在胚胎期能以無瘢痕愈合模式實現(xiàn)創(chuàng)口的愈合。其機制可能與基因的表達改變有關，也可能與某些蛋白的表達差異有關。 本實驗擬建立胎兔皮膚切割傷模型，運用雙向電泳技術分離兔皮膚組織總蛋白，經比較和分析尋找與胎兔皮膚無瘢痕愈合相關的蛋白，了解其與無瘢痕愈

2、合的關系，為實現(xiàn)對創(chuàng)傷后瘢痕增生的干預和治療提供實驗依據(jù)。為此，進行如下實驗。 方法：1.胎兔皮膚無瘢痕愈合模型的建立用小切口法對25只妊娠20天的胎兔背部致切割傷。其中5只胎兔待其出生；其余術后24h取創(chuàng)傷胎兔、同胞胎兔和其母兔皮膚組織，分別作為胎兔創(chuàng)傷(FT)組、胎兔對照(FC)組和成年創(chuàng)傷對照(ATC)組標本；用哺乳動物總蛋白提取試劑盒分別提取其皮膚組織的總蛋白；用Bradford法進行濃度測定，以確定總蛋白樣品上樣體積。

3、 2.皮膚總蛋白的雙向電泳和差異蛋白質點的質譜分析選用pH值4-7、長11cm的IPG膠條，加大電泳樣品上樣量，進行雙向電泳，總聚焦60000Vh，用10％的聚丙烯酰胺凝膠作為分離膠，最后用硝酸銀染色電泳凝膠。三組兔皮膚總蛋白雙向電泳凝膠圖分別用ImageMaster2DPlatinu圖像分析軟件進行分析和比對，尋找各組皮膚組織特異高表達的蛋白質凝膠點。 將皮膚差異表達的蛋白質點進行基質輔助的激光解析電離/飛行時間質譜(

4、Matrix-assistedlaserdesorption-ionizationtime-of-flightmassspectrogram，MALDI-TOF-MS)分析，得到各蛋白點的肽指紋圖譜，通過肽指紋圖譜檢索其相關蛋白，分析其功能。 結果：1.胎兔皮膚無瘢痕愈合模型的建立以同次妊娠的不同胎兔分別作為FT和FC，孕兔作為ATC，以保證標本遺傳背景的一致性，在一定程度上消除了個體差異帶來的影響。術后，成年孕兔均健康存活；5

5、只待產孕兔均產下存活新生兔，新生兔無明顯瘢痕形成；其余致傷胎兔存活16只，手術成功率80％；對照胎兔均成活。提示該術式適于胎兔致傷。 本實驗采用哺乳動物總蛋白提取試劑盒進行總蛋白質的提取，經檢測各批次提取蛋白質樣品的濃度提示：用哺乳動物總蛋白提取試劑盒提取兔皮膚組織的總蛋白，產品得率較高、提取效率較穩(wěn)定。 2.差異蛋白質的質譜分析因經費限制，只對FT組特異高表達的蛋白質點進行MALDI-TOF-MS分析。分析結果顯示：其

6、中7個蛋白質點的肽指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫中的已知蛋白質片段相似；10個蛋白質點的檢索得分低于76或其種屬差異過大，可能為兔未知蛋白；其余3個蛋白質點的蛋白含量可能太低或蛋白分離不徹底，沒有有意義的檢索結果。7個已知的蛋白質片段再經過同源性分析和相似性檢索，排除重復因素后確定分別是：伴侶素或線粒體蛋白P1前體、彈性蛋白(Vimentin，Vim)、微管蛋白β多肽、核不均一核糖核蛋白H(異質性胞核核糖核蛋白H)、α-烯醇酶(α-磷酸丙酮酸水合酶)

7、。 篩選出的已知蛋白分別與基因轉錄和翻譯調控、細胞信號轉導、細胞增殖、分化、發(fā)育等功能有關，與前期實驗用改良抑制性消減雜交技術在創(chuàng)傷胎兔皮膚組織中篩選出與信號轉導、細胞增殖、分化、發(fā)育相關基因的表達上調相互印證?？梢酝茰y：胎兔皮膚創(chuàng)傷后Vim、微管蛋白β多肽等促進細胞增殖、分化和發(fā)育，并維持其正常的細胞形態(tài)和結構；hnRNPH調控基因的轉錄和翻譯，促進膠原蛋白等的合成；同時伴侶素協(xié)助多肽進行折疊、組裝、轉運，并能阻止錯誤的折疊和

8、促進未折疊多肽的重折疊和正確的裝配；α-烯醇酶可能以酶的身份參與其中，調節(jié)這些過程的完成。通過這些蛋白的作用，可能使膠原纖維等成分維持正常的排列，從而抑制瘢痕的過渡增生，參與胎兔無瘢痕愈合過程。 結論：1.完善了胎兔皮膚無瘢痕愈合模型，建立了兔皮膚組織總蛋白雙向電泳技術。2.篩選出20個在FT組中特異高表達的蛋白質點，13個在FC組中特異高表達的蛋白質點，5個在ATC組中特異高表達的蛋白質點。其中FT組中與無瘢痕愈合相關的已知蛋