HIF-1α、MMP-2在退變腰椎間盤髓核中的表達及相關意義.pdf

1、研究背景：
　　 腰椎間盤突出癥是脊柱外科最常見的病癥之一,導致腰椎間盤突出癥的病理基礎主要是腰椎間盤退變(intervertebral disc degeneration；IVDD),其表現(xiàn)為凝膠樣髓核消失,髓核與纖維環(huán)原有清晰界限逐漸消失,纖維環(huán)板層粗糙和進行性纖維化。據(jù)統(tǒng)計:全世界約80％～90％的人曾經受到過腰腿痛的折磨,其中腰椎間盤退變、突出是最常見的病因,其確切的發(fā)病機制尚未完全明確,臨床治療難于達到理想境界。綜合既

2、往研究表明,IVDD是多因素協(xié)同作用導致的,包括遺傳因素、生物力學、生物化學因素等。以基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)等為代表的基質金屬蛋白酶(Matrix metalloprotelnase；MMPS)引起基質成分合成、降解紊亂而造成細胞外基質成分的變化是椎間盤力學特征喪失的直接原因之一,進而引起一系列的臨床癥狀。近年來的研究表明缺氧誘導因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α；HIF-1α)在人類突出腰椎間

3、盤中有表達,從而得出結論:HIF-1α在人椎間盤細胞的生成和突出間盤重吸收方面可能起重要作用。在人類的退變椎間盤中HIF-11α與MMP-2的表達有無相關性及它們是如何參與椎間盤的退變過程等方面尚未發(fā)現(xiàn)文獻報道。有鑒于此,本實驗通過對人類正常椎間盤和退變椎間盤組織的對比,應用免疫組織化學染色的方法,觀察和分析人類退變椎間盤中的HIF-1α和MMP-2的表達情況。
　　 研究目的：
　　 探討缺氧誘導因子-1α(HIF-1

4、α)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)在人類退變腰椎間盤髓核組織中的表達變化情況；評價HIF-1α、MMP-2在人類腰椎間盤退變過程中的作用,并分析兩者之間的關聯(lián)性。
　　 研究方法
　　 取材均來自南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院脊柱外科2008年1月～2009年6月收集的57例手術標本,分為實驗組和對照組:實驗組45例,對照組12例。實驗組為45例確診腰椎間盤突出癥需手術切除的患者,術中切除的仍位于纖維環(huán)內的椎間盤髓核組織,

5、其中男33例,女12例；年齡為20～40歲,平均年齡為31.5歲,病程為3個月～10年。突出部位:L4/L5椎間盤突出23例,L5/S1椎間盤突出20例,L4/L5、L5/S1椎間盤突出2例。根據(jù)術前MRI影像表現(xiàn),對實驗組退變腰椎間盤髓核組織分為A、B、C三組,A組:椎間盤信號強度輕度減低,B組:椎間盤信號強度中度減低；C組:椎問盤信號明顯減低；對照組12例為正常椎間盤髓核組織,來源于青年脊柱骨折患者行前路減壓內固定術時切除的椎問盤髓

6、核組織,術前MRI的T2像見椎間盤呈均勻高信號,其中男10例,女2例；年齡為21～45歲,平均33.7歲。標本取出后均用4％的多聚甲醛固定,而后立即將收集的每個椎間盤髓核組織行石蠟包埋切片,制備5μm的厚組織切片,保存于0～4℃冰箱,HE染色和待免疫組織化學檢查。
　　 HIF-1α及MMP-2均購自武漢博士德生物有限公司。具體步驟如下:①石蠟切片常規(guī)脫蠟。②3％雙氧水室溫孵育5～10 min,以消除內源性過氧化物酶的活性。③雙

7、氧水沖洗3次,熱抗原修復后,PBS(PH7.2～7.6)沖洗3min×2次,滴加5％BSA封閉液,室溫20min。甩去多余液體,不洗。④滴加適當稀釋一抗(抗人HIF-1α單克隆抗體1:100,或抗人MMP-2單克隆抗體1:100),4℃冰箱過夜。PBS洗2min×3次。⑤滴加生物素化二抗工作液,20～37℃,20分鐘。PBS洗2min×3次。⑥滴加試劑SABC,20～37℃,20min。PBS洗5min×3次。⑦顯色劑顯色(DAB試劑盒

8、)。自來水充分沖洗,復染,封片。顯微鏡觀察。
　　 HIF-1α及MMP-2免疫組化染色都定位于細胞漿,故它們的陽性結果均表現(xiàn)為軟骨細胞漿內有棕黃色或棕褐色顆粒。每張切片由兩名病理醫(yī)生在10×20光鏡下隨機選擇10個視野“盲法”閱片,確定細胞總數(shù)及陽性表達的細胞數(shù)。隨機選取10個視野內陽性軟骨細胞總數(shù)÷軟骨細胞總數(shù)×100％以計算陽性細胞百分數(shù)。采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包對計數(shù)資料進行顯著性檢驗和相關性分析。
　　

9、 結果
　　 免疫組化結果為HIF-1α及MMP-2均定位于細胞漿,故顯微鏡下見HIF-1α及MMP-2的免疫組化陽性結果均表現(xiàn)為軟骨細胞胞漿內有棕黃色或棕褐色顆粒,細胞核為淡藍色。HIF-1α在對照組、輕度退變組、中度退變組、重度退變組椎間盤髓核組織中的表達分別為8.92±3.41％、46.81±3.63％、66.88±4.60％、89.63±2.27％；MMP-2在對照組、輕度退變組、中度退變組、重度退變組椎間盤髓核組織中的

10、表達分別為9.61±3.03％、47.31±4.41％、69.54±5.96％、90.05±3.16％。HIF-1α、MMP-2在實驗組退變的椎間盤中的表達顯著高于對照組(P<0.05),而且不同退變程度的表達也不同(P<0.05),統(tǒng)計學分析均有顯著差異。組間相關系數(shù)(r)為0.959,表明HIF-1α和MMP-2在退變的椎間盤組織中的表達呈正相關的關系。
　　 結論
　　 HIF-1α、MMP-2均可能參與了人類腰椎