白藜蘆醇對食管腺癌生長抑制及放射增敏研究.pdf

1、目的：細胞周期調(diào)節(jié)紊亂在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)及其與上、下游基因形成的信號通路可影響能量代謝、自噬、細胞周期調(diào)控等過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。近年來，食管腺癌(EAC)的發(fā)病率劇增，因其總體預后較差，具有廣泛浸潤及遠處轉(zhuǎn)移等重要特征，故目前主要采取包括放療在內(nèi)的多學科綜合治療。然而，這種治療模式存在諸多副作用，尋求高效低毒

2、藥物、提高放療效果，成為近年來食管癌治療領(lǐng)域的研究熱點。作為一種具有多重藥理學活性的多酚類化合物，白藜蘆醇(RSV)的抗腫瘤作用及分子機制已引起廣泛關(guān)注。本研究應(yīng)用RSV作用于兩種食管腺癌細胞系（OE33和OE19），觀察其對細胞增殖、遷移能力及放射敏感性的影響，并探討其作用機制。
　　方法：①MTT比色法及BrdU摻入法評價RSV對EAC細胞增殖、DNA合成的影響；②貼壁實驗、劃痕試驗及穿孔試驗評價RSV對EAC細胞浸潤、遷移能

3、力的影響；③Western blot法測定AMPK蛋白、磷酸化AMPK蛋白(P-AMPK)、p27Kipl蛋白、P-p27Kipl蛋白、S期激酶相關(guān)蛋白2(Skp2)水平，特異性熒光多肽底物(Suc-LLVY-AMC)評價26S蛋白酶體活性;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測RSV對EAC細胞p27Kipl mRNA表達水平的影響;流式細胞術(shù)分析細胞周期分布變化，以探討RSV影響EAC細胞增殖、浸潤及遷移能力的機制；④通過細胞克隆

4、形成實驗檢測EAC細胞存活率，按多靶單擊模型擬合細胞存活曲線，計算反映放射敏感性的指標，包括2Gy時的細胞存活分數(shù)(SF2)、平均致死劑量(D0)、準閾劑量(Dq)和放射增敏比(SER)，以評價RSV對EAC細胞的放射增敏作用；⑤通過流式細胞儀分析單獨X線照射(IR)和IR聯(lián)合RSV對EAC細胞周期分布的影響，Western blot法半定量分析KU80蛋白、KU70蛋白、RAD51蛋白的變化，闡明RSV放療增敏的機制。
　　結(jié)果

5、：⑴MTT比色法和BrdU摻入法顯示:RSV抑制體外培養(yǎng)的OE33、OE19細胞生長及DNA合成，隨藥物濃度的增高及作用時間的延長，細胞的抑制率逐漸升高，兩種細胞在24 h的IC50分別為94.83μ M、97.07μ M；⑵不同濃度RSV作用后，OE33、OE19細胞形態(tài)不規(guī)則，體積明顯縮小，并可見核染色質(zhì)凝聚，核固縮等表現(xiàn)；⑶RSV作用于OE33、OE19細胞，細胞的貼壁能力隨藥物濃度的增高而逐漸減弱；⑷細胞劃痕試驗及穿孔試驗結(jié)果顯

6、示，OE33、OE19細胞在RSV作用下，其侵襲、遷移能力隨藥物濃度的增高而逐漸減弱;0、50、100μM RSV作用后，穿膜的OE33細胞數(shù)均值分別為196.13、67.25和25.38，穿膜的OE19細胞數(shù)均值分別為205.61、73.36和29.63，差異有顯著性；⑸流式細胞術(shù)分析表明:RSV可使G1期細胞比例增加，S期細胞比例減少;單獨X線照射(TR) OE33、OE19細胞使存活分數(shù)呈劑量依賴性下降，并出現(xiàn)G2/M期阻滯，S期

7、細胞明顯減少;50μM RSV處理24h可逆轉(zhuǎn)IR引起的G2/M期阻滯；⑹應(yīng)用western blot法和BrdU摻入法分析顯示:EAC細胞中磷酸化AMPK蛋白(P-AMPK)水平隨RSV的濃度增加而增加，總AMPK的水平及蛋白表達未見增加;AMPK蛋白抑制劑（復合物C）或轉(zhuǎn)染AMPKα siRNA，可逆轉(zhuǎn)RSV對DNA合成的抑制作用；⑺應(yīng)用western blot法及RT-PCR分析顯示:RSV能顯著增加OE33細胞p27Kipl蛋白

8、水平，但未改變p27Kipl mRNA水平;以復合物C預處理或轉(zhuǎn)染AMPKαsiRNA，均可逆轉(zhuǎn)RSV誘導的p27Kipl蛋白增加和細胞生長抑制，而未改變p27KiplmRNA水平，這表明RSV對p27Kipl蛋白的調(diào)控過程是AMPK依賴性的，而不是p27Kipl基因依賴性的；⑻AMPK激活劑(AICAR)和AMPK抑制劑（復合物C）均未改變P-p27Kipl占總p27Kipl蛋白(T-p27Kipl)的比率，并且蛋白酶體抑制劑MG13

9、2可完全阻斷復合物C對p27Kipl蛋白穩(wěn)定性的影響，這表明AMPK對p27Kipl的調(diào)控作用并非通過蛋白磷酸化而實現(xiàn)，抑制AMPK的活性時，26S蛋白酶體的活性上調(diào)而加速p27Kipl蛋白的降解；⑼特異性熒光多肽底物檢測法顯示:RSV顯著降低EAC細胞中26S蛋白酶體活性，以復合物C預處理或轉(zhuǎn)染AMPKα siRNA，均可逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)。由此可見，RSV是通過調(diào)控26S蛋白酶體通路（而不是基因轉(zhuǎn)錄變化）使p27Kipl蛋白水平升高；⑽S

10、kp2作為一種泛素-E3連接酶，對各種細胞26S蛋白酶體依賴性p27Kipl蛋白的泛素化降解起主要限速調(diào)節(jié)因子的作用。RSV可使OE33細胞Skp2蛋白水平下調(diào)，而復合物C預處理或AMPKα siRNA轉(zhuǎn)染可“抵消”RSV引起的Skp2蛋白水平降低，這表明RSV通過活化AMPK下調(diào)Skp2蛋白水平；⑾BrdU摻入法顯示，以p27Kipl siRNA轉(zhuǎn)染EAC細胞，可“抵消”AICAR或RSV對細胞生長的抑制效應(yīng)，證實RSV或AICAR可

11、“活化”AMPK蛋白、下調(diào)p27Kipl蛋白水平，抑制細胞增殖；⑿細胞克隆實驗結(jié)果:相同照射劑量下，EAC細胞的存活分數(shù)隨RSV濃度的升高而降低，相同濃度RSV，細胞的存活分數(shù)隨照射劑量的升高而降低;隨沙利度胺濃度的增加，EAC細胞的D0、Dq、SF2值均逐漸減小，SEED0逐漸增大，說明RSV對EAC細胞具有放射增敏作用，呈濃度依賴性；⒀應(yīng)用Wwestern blot法分析顯示:RSV可以使EAC細胞中RAD51蛋白（主要參與同源重組

12、修復）表達下調(diào)，RSV聯(lián)合X線照射組RAD51顯著下調(diào)，KU80、KU70無顯著變化，而單獨X線照射細胞RAD51、KU80及KU70均無顯著變化。因此，抑制RAD51蛋白表達可能是RSV增強EAC細胞放射敏感性的機制之一。
　　結(jié)論：①白藜蘆醇抑制體外培養(yǎng)的食管腺癌細胞增殖、遷移及轉(zhuǎn)移，是由于AMPK蛋白磷酸化導致26S蛋白酶體依賴性的p27Kipl蛋白增加，進而引起細胞周期重分布，即G0/G1期細胞比例增加，S期細胞比例減少。