功能性自組裝雙親多肽水凝膠支架聯(lián)合脂肪間充質干細胞智能修兔骨性關節(jié)炎的實驗研究.pdf

1、本文分五個部分進行探討。
　　第一部分：新型自組裝雙親多肽水凝膠的合成
　　目的:設計和合成促進細胞增殖和TGF-β粘附的自組裝雙親多肽水凝膠，并檢測其自組裝形成凝膠后的超微結構。
　　方法:合成的PRG和TB多肽粉劑分別溶解于去離子水中，終濃度為1％。然后再分別稀釋成0.05％(m/v)，分別取3ul的PRG，TB及兩者等體積混合的多肽溶液。原子力顯微鏡檢測多肽的超微結構。
　　結果:成功合成PRG和TB雙親多

2、肽分子,雙親多肽溶液PRG和TB混合自組裝形成凝膠。原子力顯微鏡掃描提示:PRG/TB混合水凝膠的納米纖維比PRG和TB要大，PRG，TB，PRG/TB納米纖維的平均直徑分別為(16.7±4.7nm),(18.0±1.3nm)和(28.3±5.6 nm)。
　　結論:雙親多肽PRG和TB可以混合自組裝形成納米級凝膠支架(PRG/TB),可以作為軟骨組織工程的生物支架材料。
　　第二部分：新骨性關節(jié)炎模型的研究
　　目的

3、:探討通過注射MIA的方法建立一種能模擬自然病程引起的早，中期骨性關節(jié)炎模型，用以評價組織工程修復關節(jié)軟骨的研究。
　　方法:40只新西蘭雄性大白兔子被隨機分為三組。麻醉后，通過關節(jié)穿刺的方法，每組膝關節(jié)右側注射100ul不同濃度的MIA（1mg/ml、3mg/ml和6mg/ml），左側膝關節(jié)注射PBS作為對照組。分別于2周，4周和6周拍膝關節(jié)X線，并用墨汁染色比較大體形態(tài)，組織病理染色觀察軟骨組織的退變。
　　結果:兔膝關

4、節(jié)1mg/ml MIA注射組關節(jié)退變不明顯，兔膝關節(jié)3mg/ml和6mg/ml MIA組病理染色評分和對照組比有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。但6mg/ml MIA注射組關節(jié)退變嚴重。
　　結論:通過注射3mg/mlMIA的兔膝關節(jié)可以在六周內達到類似輕，中度骨性關節(jié)炎的關節(jié)退變，為評價組織工程修復軟骨退變提供一個新的骨性關節(jié)炎動物模型參考。
　　第三部分：慢病毒載體融合蛋白TGF-β3和多肽水凝膠對脂肪間充質干細胞的生物學影

5、響
　　目的:構建出具有靶向治療功能的新型TGF-β3融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3，并通過慢病毒載體包裝后轉染脂肪間充質干細胞（ADSCs），兩者培養(yǎng)在多肽水凝膠支架內，以驗證其可行性與靶向特異性。
　　方法：消化法分離得到兔ADSCs，通過流式法鑒定ADSCs表面抗原及特殊染色法鑒定ADSCs多向分化能力。通過基因重組方法將LAP，mTGF-β3和基質金屬蛋白酶（MMP）的酶切位點PLGLWA分別插入到真核質粒表

6、達載體 GV287，得到重組TGF-β3融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3的質粒。用慢病毒載體包裝質粒后轉染ADSCs，并培養(yǎng)在PRG/TB多肽水凝膠內。CCK8法檢測增殖細胞增殖，鈣黃綠素/碘化丙啶法檢測細胞在凝膠內部的存活，Elisa法檢測MMP酶刺激后上清液中的mTGF-β3。
　　結果：成功分離培養(yǎng)出ADSCs，并且ADSCs培養(yǎng)在PRG/TB混合多肽水凝膠內可以提高增殖。慢病毒載體及PRG/TB多肽水凝膠對ADSCs

7、的毒副作用小，并且MMP酶存在時可激活重組TGF-β3融合蛋白釋放活性的TGF-β3。
　　結論：成功構建出慢病毒載體包裝的新型融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3，慢病毒載體包裝的新型融合蛋白轉染的ADSCs與PRG/TB多肽水凝膠一起具有靶向性修復軟骨缺損的應用前景。
　　第四部分：LV-mTGF-β3轉染的脂肪間充質干細胞在雙親多肽水凝膠內誘導成軟骨細胞的研究
　　目的:探討功能性自組裝 PRG/TB水凝膠支架

8、與慢病毒包裝的融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3轉染的兔脂肪間充質干細胞（ADSCs）誘導成軟骨的影響。
　　方法：將慢病毒包裝的融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3轉染第三代ADSCs后，與功能性PRG/TB水凝膠支架共同培養(yǎng)在軟骨細胞誘導液中，并增加10ng/ml基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）促進融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3釋放TGF-β3，促進ADSCs分化成軟骨細胞。3天后用Western blot檢測T

9、GF-β3在ADSCs中的表達。ADSCs誘導分化成軟骨細胞21天后，分別用Real-time PCR和Western blot檢測軟骨細胞特異性基因Aggrecan（ACAN），Ⅱ型膠原（COL2A1）和SOX-9的mRNA和蛋白的表達。
　　結果:慢病毒包裝融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3轉染ADSCs效率能達到90％以上。3天后轉染慢病毒的ADSCs成功檢測到TGF-β3的表達。與未轉染融合蛋白LAP-MMP-mTGF

10、-β3的ADSCs相比，轉染組明顯促進了ADSCs向軟骨細胞分化。21天后轉染組與未轉染組相比，ACAN、COL2A1和SOX-9 mRNA表達分別增加2.7，2.4和1.0倍，蛋白表達分別增加2.4，1.57和0.89倍。
　　結論：成功構建的慢病毒包裝融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3轉染ADSCs可促進ADSCs分化成軟骨細胞，具有很好的修復軟骨缺損的應用前景。
　　第五部分：功能性自組裝多肽水凝膠聯(lián)合LV-mTG

11、F-β3轉染的ADSCs修復骨性關節(jié)炎的研究
　　目的:進一步驗證PRG/TB自組裝多肽水凝膠支架聯(lián)合LV-mTGF-β3轉染的兔脂肪間充質干細胞（ADSCs）在體內修復軟骨的能力。
　　方法:將慢病毒包裝的融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3轉染ADSCs后，與功能性PRG/TB自組裝多肽水凝膠支架共同培養(yǎng)在軟骨細胞誘導液中。21天后，在裸鼠背部分別種植不同組的ADSCs和多肽PRG/TB自組水凝膠混合物，觀察多肽凝膠的

12、毒副作用，4W后注射部位的組織用阿利新藍染色和免疫組化染色檢測成軟骨的能力。新西蘭大白兔用注射MIA方法完成骨性關節(jié)炎造模，然后每七天注射一次多肽水凝膠和慢病毒轉染后的ADSCs混合物到骨性關節(jié)炎模型的膝關節(jié)，注射PBS作為試驗對照組。8W后，組織染色觀察多肽水凝膠聯(lián)合重組TGF-β3蛋白轉染的ADSCs修復關節(jié)的情況。
　　結果:慢病毒包裝的融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3轉染ADSCs組在裸鼠皮下生成的軟骨組織外形要大于