TGF-β1-Smad信號通路在胸主動脈夾層中的作用機制研究.pdf

1、目的:胸主動脈夾層(thoracic acute dissection，TAD)是心臟外科急重癥，嚴重危害人類生命健康，其起病急，預后差。隨著診療技術(shù)的不斷提高，TAD的診出率逐年提高，臨床資料統(tǒng)計其發(fā)病率約為3-6/100000。在保守治療下，50-68％的TAD患者在發(fā)病后48小時內(nèi)死亡，并且隨病程進展死亡率呈上升趨勢。目前治療TAD的方法主要是胸部開放手術(shù)及微創(chuàng)下腔內(nèi)隔絕術(shù)，但開放手術(shù)時間長、術(shù)中操作復雜，術(shù)后并發(fā)癥較多，腔內(nèi)隔絕

2、術(shù)適應證較窄，因此有必要從TAD的發(fā)病原因及機制方面探究預防及治療TAD的新的方法，更好地改善患者的預后。
　　許多研究表明血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的生物學功能異常參與了TAD的發(fā)生與發(fā)展，其中VSMC的表型轉(zhuǎn)換是關(guān)注的熱點。VSMC存在兩種表型，一種是收縮型（分化型），特點是其調(diào)節(jié)血管壁張力及維持彈性能力強，增殖、遷移功能差，一種是分泌型（去分化型），特點是其增殖、遷移能

3、力強，維持血管壁力學屬性能力差。正常狀態(tài)下，VSMC主要以收縮型存在，但在比如TAD等病理條件下，VSMC則主要以分泌型存在，這種現(xiàn)象提示我們VSMC的表型轉(zhuǎn)換可能與TAD的發(fā)生發(fā)展有相關(guān)性。
　　已有大量文獻證實TGF-β1/Smad信號通路參與生物體內(nèi)眾多生理病理過程，包括細胞分化、增殖及凋亡，相關(guān)研究表明TGF-β1/Smad信號通路參與VSMC的功能異常過程。TGF-β1/Smad信號通路無法直接將信號傳導至細胞核內(nèi)，其必

4、須與一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合發(fā)揮作用。Nanog被證實是維持胚胎干細胞增殖性的重要因子，并且受到Smad2的直接調(diào)控，但關(guān)于Nanog是否可以維持VSMC的增殖性（分泌型）參與TAD的發(fā)病未見報道。本研究目的是明確TGF-β1/Smad信號通路是否通過調(diào)控Nanog促進VSMC的表型轉(zhuǎn)換從而誘導TAD的發(fā)病。
　　方法:本研究分為以下三部分。1、收集TAD患者主動脈壁組織標本（13例）與無主動脈疾病尸檢或捐贈者的主動脈壁組織標本（10例）

5、，利用RT-PCR、WesternBlot實驗技術(shù)在mRNA及蛋白水平檢測TGF-β1、Smad、Nanog及相關(guān)信號因子在正常與病變血管壁組織中的表達有無差異，利用免疫組織化學染色技術(shù)對比正常主動脈組織和TAD主動脈組織中TGF-β1、Smad、Nanog及相關(guān)信號因子表達量和表達部位的差異。2、收集無主動脈疾病尸檢病人的新鮮主動脈組織，培養(yǎng)中膜層VSMC。用TGF-β1細胞因子刺激VSMC，以同株人VSMC作對照，采用RT-PCR及

6、Western Blot技術(shù)對比TGF-β1細胞因子刺激組和空白對照組中Smad2、Smad3及α-SMA的mRNA及蛋白表達差異。3、收集無主動脈疾病尸檢病人的新鮮主動脈組織，培養(yǎng)中膜層VSMC。用TGF-β細胞因子刺激VSMC，以同株人VSMC作對照，采用RT-PCR及Western Blot技術(shù)對比兩類細胞中Nanog及α-SMA的mRNA及蛋白表達差異;然后以SiRNA干擾VSMC（TGF-β1細胞因子刺激組）中Nanog基因的

7、表達，采用RT-PCR及Western Blot技術(shù)驗證干擾Nanog前后VSMC中α-SMA的表達量差異;采用染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，CHIP)技術(shù)驗證Smad2是否直接結(jié)合Nanog啟動子區(qū)。
　　結(jié)果:
　　1、主動脈組織中TGF-β1、Smad、Nanog及相關(guān)信號因子的表達情況:RT-PCR結(jié)果表明，TAD組主動脈壁組織中TGF-β1、TGFβ-R1、Smad2

8、、Smad3、Smad4、Nanog的mRNA表達水平均高于正常對照組(p＜0.05)。Western Blot結(jié)果顯示，TGF-β1、TGFβ-R1、Smad2、Smad3、Smad4、Nanog蛋白在TAD中表達水平高于正常對照組(P＜0.05)。免疫組織化學染色表明TAD主動脈組織中TGF-β1、TGFβ-R1、Smad2、Smad3、Smad4、Nanog的信號強于正常對照組(P＜0.05)。
　　2、TGF-β1、Sma

9、d與VSMC表型轉(zhuǎn)換的關(guān)系:TGF-β1細胞因子刺激人原代主動脈VSMC后，Smad2、Smad3較空白組表達量上調(diào)(P＜0.05)，α-SMA表達較空白組下降(P＜0.05)。
　　3、Smad2調(diào)控Nanog促進VSMC表型轉(zhuǎn)換的研究:人原代主動脈VSMC加入TGF-β1細胞因子后，Nanog表達量較空白組上調(diào)(P＜0.05)，α-SMA表達量較空白組下降(P＜0.05)，然后利用SiRNA干擾Nanog后，α-SMA表達量上

10、升(P＜0.05); CHIP實驗結(jié)果表明Smad2結(jié)合于Nanog啟動子區(qū)-298bp到-80bp之間。
　　結(jié)論:
　　1、TGF-β1、Smad、Nanog及相關(guān)信號因子在TAD組表達量高于正常對照組，提示其與TAD的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。
　　2、TGF-β1細胞因子刺激人原代主動脈VSMC后Smad2及Smad3 mRNA表達量上升、α-SMA mRNA表達量下降，提示TGF-β1、Smad2、Smad3參與V