人胚胎生殖細胞自我更新及分化的機制研究.pdf

1、研究背景: 1998年美國科學家先后從囊胚內細胞團(inner cell mass，ICM)及原始生殖細胞(primordial germ cells，PGCs)中分離得到人 ES細胞系(embryonic stem cells)和人EG細胞(embryonic germ cells)。它們在體外具有的無限增殖和多向分化能力使其成為胚胎早期發(fā)育研究、細胞治療和組織工程等領域的重要工具。因此，明確其自我更新和多向分化的調控機制是胚

2、胎干細胞廣泛應用的前提。 PGCs 是指在進入與體細胞有密切接觸的生殖腺成為真正的生殖細胞之前，短暫存在于胚胎的雙倍體生殖細胞前體。從系統發(fā)育學的觀點來說，生殖細胞是至關重要的，因為它承載著遺傳信息，并使之代代相傳，而體細胞則為生殖細胞提供保護和營養(yǎng)。因而，只有了解生殖系從PGCs到成熟配子的發(fā)育過程才能洞悉人類胚胎發(fā)生的起源。從干細胞生物學的角度而言，原始生殖細胞是成熟配子的前體，將其看作干細胞是無可爭議的。 hEG

3、細胞培養(yǎng)的困難相對較大。1998 年至今僅少數幾個實驗室宣布獲得了 hEG 細胞，且至今尚未獲得可長期培養(yǎng)的 hEG 細胞，因此優(yōu)化 hEG 細胞培養(yǎng)體系必將推動其深入研究。hEG 細胞的基本培養(yǎng)基中需添加多種細胞因子以維持其在未分化狀態(tài)下的增殖，包括白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)、干細胞生長因子(Stem cell factor，SCF)、成纖維細胞生長因子(Fibroblast gro

4、wth factor，FGF)、 Forskolin 等。同時，hEG 細胞的生長還依賴于飼養(yǎng)層細胞的支持。傳統培養(yǎng)體系中，飼養(yǎng)層主要采用小鼠成纖維細胞系STO或原代MEF，可能導致培養(yǎng)體系的鼠源性污染?？傊?，hEG 細胞的深入研究和臨床應用的前提是建立安全、有效的培養(yǎng)體系。 本實驗分離人5-9周流產胚胎生殖嵴，以表達LIF基因的人胚肺成纖維細胞(LIF-expressing human embryonic lung fibro

5、blasts，hELF/lif)作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)hEGC，并對其生物學特性進行鑒定，旨在為hEG細胞培養(yǎng)體系的建立和優(yōu)化奠定基礎。自2003年以來，已有實驗室報道獲得ES細胞來源的生殖細胞。2004年底，Science期刊將“體外系統中ES細胞分化產生生殖細胞”的發(fā)現列為該年的十大突破進展之一。由胚胎干細胞分化為生殖細胞，除為生殖系統發(fā)育提供可研究的模型外，無疑還將為獲得成體生殖細胞提供很好的材料，因此具有極大的理論和實際價值。特別的是，

6、EG細胞作為生殖系本身來源的多能干細胞，將其作為向生殖細胞分化的種子細胞較ES細胞更為適合。此外在體內發(fā)育過程中，PGCs遷移到生殖嵴，增殖到足夠數量后，即觸發(fā)減數分裂，分化為生殖系干細胞。但是，維持自我更新和觸動分化過程中發(fā)揮作用的轉錄調控因子，目前仍不清楚。由于原始生殖細胞缺乏特異性標記，同時受標本來源的限制，使得長期以來對PGCs分化機制的研究較少。hEG細胞來源于生殖系統，本實驗將PGCs來源的hEG細胞進行體外“順勢分化”，研

7、究分化過程中多能干細胞標記Oct4、Nanog，生殖系標記Stella、VASA，減數分裂相關標記SCP1、SCP3、GDF9、TEKT1的表達，探討PGCs曾,殖分化機制。研究結果一、以轉染 LIF 基因的人胚肺成纖維細胞為飼養(yǎng)層培養(yǎng)人胚胎生殖細胞原代來源的人胚肺成纖維細胞形態(tài)典型，增殖旺盛。LIF 基因真核表達載體轉染后的細胞經 G418 篩選后得到可傳代陽性克隆，經RT-PCR和western-blot鑒定均能穩(wěn)定表達LIF。

8、 分離5-9周胚胎生殖嵴細胞，種植到hELF/lif細胞制成的飼養(yǎng)層上，在培養(yǎng)基中不添加外源性LIF蛋白的條件下，PGCs 來源的 hEG 細胞形成典型的鳥巢狀集落，集落呈高度的堿性磷酸酶活性，胚胎特異抗體SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81 陽性。表達未分化標志 Oct-4，Nanog 和 Rex-1，以及端粒酶活性標記：hTERT。染色體分析培養(yǎng)25天后的細胞為正常人染色體核型。具有hEG細胞的形態(tài)學及

9、生物學特性。免疫組化和免疫熒光分析發(fā)現：14天EB表達組織特異性標志Desmin 和 AFP。之后分別對未分化 hEG 細胞，第 7 天 EB 細胞和第 14天 EB 細胞進行的 RT-PCR 分析發(fā)現：隨分化程度增加，EB細胞表達三個胚層來源細胞標志，分別為內胚層：α-FP，Pdx-1；中胚層：CD34，enolase；外胚層：Vimentin，NF68，表明 hEG 細胞具有向三個胚層分化的多向潛能。分別收集在hELF和hELF/l

10、if細胞上生長7天和10天的hEG細胞，進行RT-PCR分析。hEG細胞中能檢測到LIFR的表達，但僅在hELF/lif細胞上生長的hEG細胞中檢測到LIF信號通路靶基因c-myc的表達，提示在hELF/lif飼養(yǎng)層上生長的hEG細胞中LIF信號通路被激活。二、hEG細胞向生殖細胞分化及其調控機制RT-PCR的方法分析表明：未分化hEG細胞有較高水平的Oct4和Nanog表達，而hEG細胞一旦分化形成為EB (Day3)，Nanog表達

11、水平立即顯著下降，并隨進一步分化下降到檢測不到的水平。而Oct4在hEG細胞分化后表達水平下降，但仍保持一定的表達。生殖系標志分子STELLA，PGCs細胞后期(遷移到生殖嵴，減數分裂前)階段特異性基因VASA從EB形成第7天被檢測到，表達水平持續(xù)上升，同時，卵母細胞特異性基因GDF9和精原細胞特異性基因TEKT1分別從EB形成第3天，和EB形成第7天開始被檢測到。減數分裂標志SCPI在EB中也被檢測到。 對hEG細胞和EB進行

12、免疫熒光分析發(fā)現：未分化hEG細胞胞漿表達Nanog，而EB中表達減數分裂標志分子SCP3啪細胞的Nanog表達是缺失的。分別對第7周胚胎和第13周男性及女性胚胎生殖嵴進行檢測，結果表明：Nanog在PGCs遷移發(fā)育階段(第7周)大量表達；而PGCs到達生殖嵴后，男性生殖細胞停滯在有絲分裂階段，女性生殖細胞在進入減數分裂(第13周)后Nanog的表達立即下降到檢測不到的水平。因此，Nanog在抑制胚胎生殖細胞分化中可能發(fā)揮重要作用。Na

13、nog表達下調是體內觸動生殖細胞減數分裂的必要條件，而體外受Oct4轉錄調控的Nanog表達水平下降可能是促進hEG細胞分化的直接原因。上述結果顯示本培養(yǎng)體系中的hEG細胞具有向生殖細胞分化的能力，并具有減數分裂的潛能。結論原始生殖細胞是成體生殖細胞的前體，而成體配子融合又將形成受精卵，從而啟動胚胎發(fā)育全過程，因此 PGCs 攜帶遺傳信息起著傳承生命的作用，在胚胎發(fā)育中具有至關重要的地位，同時又作為體外培養(yǎng)胚胎干細胞的來源之一，具有臨床

14、應用的巨大潛力。國內外科研工作者圍繞維持 PGCs 未分化狀態(tài)及多能性的分子調節(jié)機制作了大量研究，但具體機制仍不清楚。進一步探討 hEG 細胞自我更新及分化過程中關鍵因子的功能，具有發(fā)育生物學和干細胞治療學的雙重意義。 建立無異種動物成分污染的培養(yǎng)系統是胚胎干細胞技術發(fā)展的必然趨勢。本研究將LIF基因轉入hELF細胞中，建立人來源的能分泌LIF活性蛋白的新的飼養(yǎng)層來支持人hEG細胞的體外生長。為優(yōu)化hEG細胞培養(yǎng)體系奠定基礎。在

15、此過程中獲得人LIF基因真核表達載體、穩(wěn)定表達LIF的人胚肺成纖維細胞等材料也可成為多功能細胞因子LIF功能的研究工具。 本實驗關于hEG細胞向生殖細胞分化過程中分子表達變化的研究，為人類生殖系統發(fā)育這一長期困擾生物界的難題提供了線索，也為重要轉錄因子在胚胎干細胞自我更新中的作用研究提供了證據。在本研究前期建立的以hELF/lif飼養(yǎng)層為基礎的hEG細胞培養(yǎng)體系中生長的hEG細胞，分化形成EB，表達生殖細胞和減數分裂標志分子，具