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文檔簡介
1、基因治療已用于治療癌癥等疾病,其中基因載體的開發(fā)是關鍵。陽離子脂質體作為基因載體,具有制備簡便、重復性好、生物降解性好和易于商品化等優(yōu)點,目前已經(jīng)越來越受到科研人員的關注。但現(xiàn)有陽離子脂質體還存在轉染效率較低和一定的細胞毒性。
針對上述問題,本論文設計合成了三個新型的以季銨鹽為頭部,蔗糖為骨架,酯鍵為連接鍵,不同長度的烷基鏈(C12,C14和C16)為疏水尾部的蔗糖酯型陽離子類脂,將其構建成陽離子脂質體,作為基因載體用于基因轉
2、運。所合成的三個季銨鹽化合物經(jīng)柱層析和重結晶分離提純后,得到HPLC純度97%以上的產(chǎn)物。采用ESI-MS、Q-TOF-MS、IR、1HNMR和13C NMR表征,證明結構正確。
將所合成的蔗糖酯型陽離子類脂用薄層分散與超聲分散相結合的方法制備成陽離子脂質體,并采用透射電鏡、動態(tài)光散射以及Zeta電位儀等手段對其進行研究,發(fā)現(xiàn)所制備的脂質體基本呈橢球形,尺寸在100-300 nm之間,脂質體的表面都帶正電荷,電位在25-90
3、mV之間。
利用瓊脂糖凝膠電泳以及Zeta電位儀等手段研究了脂質體與DNA的結合能力。結果表明,陽離子脂質體對DNA有延滯作用,所制備的陽離子脂質體均可與DNA形成復合物,且隨著脂質體與DNA比例(N/P比)的增大,脂質體與DNA的結合能力增加;在陽離子脂質體中分別加入助類脂二油?;字R掖及?DOPE)或膽固醇(Chol)后,結合DNA的能力增強,均能在N/P比為10/1時完全延滯。隨著疏水鏈長度的增加,與DNA結合能力增
4、強。
利用合成的蔗糖酯型陽離子類脂結合助類脂和pDNA(或siRNA)構建了蔗糖酯型陽離子類脂/助類脂/pDNA(或siRNA)三元復合載體,以此作為基因運載工具,對癌細胞進行了體外轉染或基因沉默研究。體外轉染研究結果表明,當脂質體與DNA比例在4/1附近時蔗糖酯型陽離子脂質體的轉染效果最佳;類脂與助類脂DOPE和Chol的比例分別為1/1和3/1時,轉染效率最高,膽固醇可提高三元復合載體的核酸遞送效率,約為加入DOPE的1.
5、1倍;此外,十二和十四碳尾部的脂質體轉染效率明顯優(yōu)于十六碳尾部的脂質體;陽離子類脂(TSI12+C3/1和TSI14+C3/1)進行優(yōu)化后轉染效率明顯優(yōu)于商品試劑2,3-二油氧基丙基三甲基氯化銨(DOTAP)與商品試劑Lipofectamine2000相當?;虺聊芯拷Y果顯示,經(jīng)過優(yōu)化后三元復合載體可在A549細胞中高效沉默目的基因,由膽固醇構建的三元復合載體(TSI14+C3/1)獲得基因沉默的效果最佳,抑制率約為97%,優(yōu)于商品轉
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