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文檔簡介
1、本文以中藥材土貝母為原料,采用溶劑法——柱層析法從中分離純化得到抗癌活性成分土貝母皂苷(皂苷)和土貝母苷甲(苷甲),并重點研究了皂苷、苷甲的抗微管作用及對人低分化上皮樣鼻咽癌細胞(CNE-2Z)凋亡的影響?! ?.采用AKTATMexplorer100快速純化工藝開拓系統(tǒng),在實驗條件下快速分離得到皂苷和苷甲,為土貝母皂苷成分分離提取工藝的簡化作了有益的探索?! ?.本文較系統(tǒng)研究了苷甲的抗微管作用,研究認為5μmol/L苷甲即可抑制
2、離體條件下豬腦微管蛋白加熱聚合,當其濃度在5~10μmol/L時,苷甲對微管蛋白聚合的抑制作用與苷甲的濃度呈正相關(guān)。 3.采用細胞免疫熒光法研究皂苷、苷甲對CNE-2Z細胞微管網(wǎng)絡(luò)的影響。25μmol/L的皂苷、苷甲作用CNE-2Z細胞3h后,熒光圖像顯示其結(jié)果與2.5μmol/L秋水仙堿作用細胞3h的結(jié)果相似,熒光充滿整個細胞質(zhì)區(qū)域,正常細胞所具有的毛玻璃樣微管網(wǎng)絡(luò)消失,表明皂苷、苷甲引起細胞微管解聚,2.5μmol/L紫杉醇處理
3、細胞3h后,細胞內(nèi)熒光主要呈束狀或晶核樣,提示微管蛋白聚合。 4.采用透射電鏡觀察皂苷、苷甲對CNE-2Z細胞超微結(jié)構(gòu)的影響。正常培養(yǎng)的細胞結(jié)構(gòu)完整,微管清晰可見;25μmol/L的皂苷、苷甲作用24h后,多數(shù)細胞均不同程度受損,細胞的微絨毛減少乃至消失;微管網(wǎng)絡(luò)消失;細胞變圓;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)彎曲、折疊;線粒體受損,表現(xiàn)為線粒體腫脹或皺縮,數(shù)量減少;胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量自噬泡;細胞核界限不完整,核固縮或碎裂;細胞質(zhì)溶解,呈現(xiàn)典型的凋亡或壞死特征。
4、50μmol/L皂苷作用24h,則大多細胞壞死?! ?.蛋白免疫印跡結(jié)果證實10μmol/L皂苷、苷甲作用CNE-2Z細胞24h,細胞內(nèi)聚合的微管蛋白減少,解聚的微管蛋白相應(yīng)增加。25μmol/L皂苷、苷甲分別作用細胞1h,6h,12h和24h,細胞內(nèi)解聚的微管蛋白比例呈時間依賴上升?! ?.通過分子生物學方法進一步證實皂苷、苷甲誘導(dǎo)CNE-2Z細胞凋亡。試驗條件下皂苷及苷甲均使細胞Bcl-2蛋白表達減少,Raf-1蛋白磷酸化活化。
5、隨著藥物作用濃度升高,時間延長,Bax及磷酸化Raf-1蛋白表達增多。Raf-1蛋白因為磷酸化而活化,啟動細胞凋亡;而Bcl-2和Bax分別抑制和促進細胞凋亡?! ?.采用血清饑餓法對CNE-2Z細胞進行簡單的周期同步化處理后,用流式細胞術(shù)測定25μmol/L皂苷、苷甲作用24h后各時相的CNE-2Z細胞分布情況,結(jié)果表明實驗條件下皂苷、苷甲對CNE-2Z細胞周期影響不大?! ”狙芯康奶厣蛣?chuàng)新之處: 1.利用制備型液相色譜簡單
6、快速地分離到到土貝母中皂苷、苷甲有效成分。土貝母直接入藥時有效成分不明確,劑量不確定,毒副作用大。苷甲的抗腫瘤作用強,毒副作用小,且得率高(1.9%),水溶性和穩(wěn)定性都較好。從增加得率,簡化工藝和降低成本的角度考慮,皂苷和苷甲應(yīng)該首先開發(fā)利用?! ?.在我國,鼻咽癌是嚴重威脅人們健康的十大惡性腫瘤之一。臨床上鼻咽癌以放療為首選,目前尚無低毒高效的化療藥物。皂苷及苷甲對人低分化鼻咽癌CNE-2Z細胞株表現(xiàn)出明顯的細胞毒作用,誘導(dǎo)細胞凋亡
7、,且前期的研究工作已證實皂苷、苷甲達到有效劑量時對人體無明顯毒副作用,皂苷、苷甲是具有潛力的鼻咽癌化療藥物。這是本文研究中最重要的創(chuàng)新之處?! ?.腫瘤細胞失去了正常細胞的控制機制,癌組織中的細胞更傾向處于分裂期,而微管轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N體是細胞分裂中的一個重要事件。正常細胞的骨架完整,修復(fù)快,藥物不易對其造成損傷。腫瘤細胞骨架不完整,組裝程度差,藥物作用后不能及時有效地修復(fù),導(dǎo)致細胞增殖被抑制,因而近年來,抗微管藥物的研究開發(fā)倍受矚目。本研
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