人iPS細(xì)胞株的建立與ABCG2在人多能分化干細(xì)胞中缺失的意義探討.pdf

1、人胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)由于自身所具有的多向分化潛能和無限增殖的能力使它擁有廣闊的基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用前景。但是，人ES細(xì)胞建系過程中需要破壞受精卵或囊胚，因此，倫理問題成為ES細(xì)胞研究無法逾越的障礙；此外，從ES細(xì)胞中獲得的功能細(xì)胞對患者來說屬于異體細(xì)胞，細(xì)胞治療時的免疫排斥問題嚴(yán)重阻礙了它的臨床研究進展。在這種背景下，通過在分化的體細(xì)胞中表達(dá)特定的幾個轉(zhuǎn)錄因子，以誘導(dǎo)體細(xì)胞的重編程而獲得的可不斷自我更

2、新且具有多向分化潛能的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(inducedpluripotent stem cell，iPSC)誕生了，由于它具有跟成體細(xì)胞完全相同的遺傳背景，又不涉及倫理道德問題，因此在應(yīng)用潛能方面顯示出無比優(yōu)越性。但是，iPS細(xì)胞是否真正具備與ES細(xì)胞相同的分化能力和分化效率，是否能夠為將來的臨床移植提供具備相應(yīng)功能的供體材料，近年來一直是干細(xì)胞領(lǐng)域中所被高度關(guān)注的焦點。
　　 干細(xì)胞中的旁系群體(side population

3、，SP)也一直是干細(xì)胞研究的熱點之一。對于眾多干/祖細(xì)胞而言，一個非常顯著的共性就是跨膜蛋白ATP綁定結(jié)構(gòu)(ATP-Binding cassette，ABC)超家族成員之一，半轉(zhuǎn)運子ABCG2的表達(dá)。它們介導(dǎo)著包括細(xì)胞毒性藥物、類固醇、多肽、磷脂等在內(nèi)的多類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。ABCG2對熒光染料Hoechst33342的特異性排除，被認(rèn)為是干細(xì)胞中SP分選的分子基礎(chǔ)，因此被用做這類細(xì)胞的特異性標(biāo)記。然而ABCG2是否在人ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞中

4、表達(dá)?干細(xì)胞SP分選的“黃金法則”是否也同樣適用于這些細(xì)胞呢?
　　 帶著這些問題，開始了我們的課題研究。整個課題是由三大研究部分所構(gòu)成：第一部分-“人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)的建立”，第二部分-“人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)的多項分化和第三部分-“剖析在人胚胎干細(xì)胞(hESCs)和誘導(dǎo)多能分化干細(xì)胞(iPSCs)中膜轉(zhuǎn)運子ABCG2的表達(dá)與意義”。
　　 第一部分主要為iPS實驗技術(shù)平臺的建立。我們分別采用慢病毒

5、轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，將不同的轉(zhuǎn)錄因子組合(Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4或Oct4，Sox2，Nonog，c-Myc，Klf4和Lin28)導(dǎo)入人胎肺成纖維細(xì)胞(IMR-90)中，成功將其誘導(dǎo)成為具有完全相同遺傳背景的iPS細(xì)胞株。經(jīng)相關(guān)檢測，發(fā)現(xiàn)這些iPS細(xì)胞均表達(dá)特異性多能分化標(biāo)記，且能在小鼠體內(nèi)形成包含三個胚層的畸胎瘤，提示它們具備跟ES細(xì)胞相似的多向分化潛能。
　　 第二部分主要為包括造血、神經(jīng)以及滋

6、養(yǎng)層細(xì)胞在內(nèi)的iPS細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化。我們根據(jù)在人ES細(xì)胞的培養(yǎng)和分化的經(jīng)驗，分別將我們所建立的iPS細(xì)胞系分化成造血細(xì)胞、神經(jīng)上皮細(xì)胞、各類終末神經(jīng)元以及滋養(yǎng)層細(xì)胞，并特別比較了人的ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞的神經(jīng)分化效率。結(jié)果表明，我們所得到的iPS細(xì)胞均具備向上述各類細(xì)胞分化的能力，而且經(jīng)功能學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)將其誘導(dǎo)生成的運動神經(jīng)元被激發(fā)后可產(chǎn)生與ES細(xì)胞來源運動神經(jīng)元相似的動作電位，提示這類神經(jīng)元是具備相關(guān)感觸和傳導(dǎo)功能的，有望用于將來的

7、臨床神經(jīng)退行性病變的治療，但是不同iPS細(xì)胞系在神經(jīng)分化的效率上存在著差異，其深層次的機制目前尚不可知。
　　 第三部分是一項發(fā)現(xiàn)導(dǎo)向型課題。我們在對人ES細(xì)胞及iPS細(xì)胞的研究過程中發(fā)現(xiàn)了一個非常奇特的現(xiàn)象，那就是區(qū)別于其他類型的干/祖細(xì)胞，人的ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞胞核能夠被熒光染料hoechst所染色，通過進一步實驗證明這種現(xiàn)象是由于干細(xì)胞SP的分選標(biāo)記-ABCG2在人ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞中的缺失所導(dǎo)致的。并且恰恰相反，通過

8、常規(guī)方法hoechst染色對人ES細(xì)胞進行流式細(xì)胞術(shù)分選，得到拒染Hoechst的“SP”細(xì)胞實際上是多能分化基因已經(jīng)下調(diào)的分化細(xì)胞，證明經(jīng)典的干細(xì)胞“SP”的定義與分選并不適用于人的多能分化干細(xì)胞(ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞)。而有趣的是，來源于人ES細(xì)胞的滋養(yǎng)層細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞卻能夠表達(dá)ABCG2因而可以拒染hoechst。與之相對，我們在小鼠的ES細(xì)胞中檢測到ABCG2的表達(dá)以及對Hoechst的拒染，而在小鼠的滋養(yǎng)層細(xì)胞中卻未發(fā)現(xiàn)其表

9、達(dá)。在人ES細(xì)胞中強行表達(dá)ABCG2則可以顯著增強它們對熒光染料hoechst和化療藥物米托蒽醌(mitoxanthrone，MTX)的抵抗性，并且大部分人ES細(xì)胞在撤去生長因bFGF(3天)后仍能維持其自我更新(self renew)狀態(tài)。我們在表達(dá)ABCG2的人ES細(xì)胞中還發(fā)現(xiàn)磷酸化的AKT表達(dá)水平顯著升高，提示ABCG2可能通過激活FGF信號通路的重要分支PI3K/AKT而降低人ES細(xì)胞對于子bFGF的依賴性，但是這其中的具體機制

10、還有待進一步探討。
　　 綜上所述，我們成功地通過不同的病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立了iPS技術(shù)平臺，并進一步將所建立的iPS細(xì)胞系分化成造血干/祖細(xì)胞，神經(jīng)上皮細(xì)胞和區(qū)域神經(jīng)元，以及滋養(yǎng)層細(xì)胞，比較它們神經(jīng)分化能力的差異并進行部分功能檢測，初步探討其做為不同細(xì)胞種類的移植候選物的可能性。同時我們首次系統(tǒng)性地闡述了干細(xì)胞SP分選標(biāo)記ABCG2在人多能分化干細(xì)胞(ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞)中的缺失，對于重新認(rèn)識干細(xì)胞中的旁系群體、ABCG2與干細(xì)