BF2-肽四聚體的構建及其在傳染性支氣管炎病毒特異性T細胞反應評價中的應用.pdf

1、1996年建立的MHIC l類分子/肽四聚體技術，是一種檢測特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicT lymphocytes.CTLs)的方法。該方法已在人類及模擬動物的相關領域得到較為廣泛的研究和應用,然而在獸醫(yī)學相關研究中，只有近年來在豬和馬上有了初步的研究。目前，該項技術在禽類的研究尚屬空白. 為了構建雞的MHC/肽四聚體,本實驗從SPF萊航雞全血克隆了雞MHC l重鏈α(BF2)和β2微球蛋白(Chβ2m)全基因,

2、經(jīng)系統(tǒng)進化分析表明本實驗所獲得的BF2基因為B15單倍型.然后利用軟件分析了其各自的信號肽序列及BF2的跨膜區(qū),利用引物分別缺失了這兩段基因的信號肽序列以及BF2的跨膜區(qū),并在BF2基因的3'端融合了BirA底物肽(BSP)序列.將經(jīng)改造的兩段基因分別克隆至融合蛋白重組表達載體中,分別命名為pET-BF<,2>-BSP和pET-Chβ2m,并將其分別轉化至大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)中進行誘導表達,獲得了包涵體表達的重組蛋白,表達產

3、物溶解于8M脲中,經(jīng)SDS-PAGE分析,結果表明所得融合目的蛋白分別約為38kD和15kD,Western-blot。結果顯示，該重組蛋白均成功地融合了6xHis標簽.為了獲得大量的目的蛋白,優(yōu)化了誘導劑濃度、起始誘導菌體濃度及誘導時間等表達條件.此外,建立了重組蛋白BF2-BSP和Chβ2m在變性狀態(tài)下通過鎳柱親和層析純化包涵體的方法,獲得了高純度的重組蛋白BF2-BSP和Chβ32m. 根據(jù)文獻所報道,合成了雞傳染性支氣管

4、炎病毒(IBV)核蛋白N<,71-78>T細胞表位肽,將其與純化后的重組蛋白BF2-BSP和Chβ2m在重折疊緩沖液中復性.復性后在快速蛋白液相色譜儀(FPLC)上分離出復性組裝成功的.BF2/肽單體復合物.將該單體復合物在體外進行生物素化,其產物再次采用FPLC通過分子篩分離出生物素化后的BF2/肽單體復合物:通過鏈霉親和素遷移實驗檢測體外生物素化效率,然后將生物素化后的BF2/肽單體復合物與藻紅蛋白(PE)標記的鏈霉親和素按一定比例

5、反應生成BF2/肽四聚體. 為了檢測所制備BF2/肽四聚體的功能,采用10<'5.5>EID<,50>的lBVH52株接種一周齡SPF雞,10d后采抗凝血用淋巴細胞分離液分離PBMC,調整細胞濃度后取1×10<'6>個細胞進行抗雞CD8單抗和BF2/肽四聚體雙色熒光染色,采用流式細胞術檢測并分析染色結果,結果表明所制備的BF2/肽四聚體可用丁檢測lBv N蛋白特異性T淋巴細胞,檢測一周齡SPF雞接種H52后10d時針對N蛋白的特

6、異性T細胞比率為3.65﹪. 為了探討SPF雞在感染IBV后體內抗體水平及針對N 蛋白特異性的T淋巴細胞的動態(tài)變化,將125羽SPF雞隨機分為二組分別作為接種免疫組、攻毒對照組和空白對照組.采川IBVH52標準毒株對其通過滴鼻方式進行免疫,之后每3天剖殺5羽觀察各臟器的病理學變化、檢測血清抗體效價并采用BF2/肽四聚體評價其N蛋白特異性T細胞的比例:免疫15d時采用IBV M41對免疫組和攻毒對照組進行攻毒,同樣檢測上述指標.最