ATRA增強HSV-TK-GCV對膀胱癌旁觀者效應的實驗研究.pdf

1、研究背景:膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,術(shù)后高復發(fā)率和對化療藥物的不敏感一直影響著膀胱癌的療效.單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因轉(zhuǎn)染治療膀胱腫瘤是目前腫瘤基因治療的重要策略之一,顯示了較好的研究價值和臨床應用前景.實驗已證實"旁觀者效應"即轉(zhuǎn)染陽性細胞使未轉(zhuǎn)染細胞凋亡是TK基因治療另一重要作用途徑,它與基因轉(zhuǎn)染效率被看成腫瘤自殺基因治療成功的兩大關(guān)鍵要素.在目前基因轉(zhuǎn)染效率還不盡如意的情況下,旁觀者效應的作用越來越受重視,探討

2、如何提高旁觀者效應是很有意義的.許多實驗已證實縫隙連接細胞間通訊(GJIC)是實現(xiàn)旁觀者效應主要機理之一.相鄰細胞膜上的連接蛋白構(gòu)成的連接子相互錨定形成中空的連接通道是細胞間通訊的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).然而,在許多腫瘤中,組織特異性連接蛋白表達異常,引起細胞間通訊功能下降,這是自殺基因"旁觀者效應"在許多腫瘤中不明顯的原因之一.國外許多實驗已證實,膀胱移行上皮主要表達連接蛋白Cx26,在調(diào)節(jié)移行細胞增殖和分化起重要作用.它的異常表達及細胞間通訊功能

3、下降與膀胱腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān).通過提高腫瘤細胞連接蛋白的表達,改善細胞間通訊可望提高自殺基因治療的旁觀者效應.全反式維甲酸(ATRA)是人工合成維生素A衍生物,具有良好的調(diào)節(jié)細胞間通訊功能的作用,但是,對不同類型細胞的調(diào)節(jié)作用不同.目前,連接蛋白Cx26在膀胱癌中的表達情況如何,以及ATRA能否調(diào)節(jié)膀胱癌細胞的GJIC功能,目前的研究極少.實驗目的:基于目前的研究現(xiàn)狀,我們在該實驗中:1、觀察膀胱移行細胞癌中Cx26表達情況及生物

4、學意義.2、體外觀察ATRA是否有提高HSV-TK/GCV對膀胱癌細胞的旁觀者殺傷作用,探討其作用機理是否與提高Cx26的表達及改善膀胱癌細胞細胞間通訊有關(guān).為聯(lián)合應用ATRA 和HSV-TK/GCV基因系統(tǒng)治療膀胱癌提供理論依據(jù).實驗方法和結(jié)果:1、通過免疫組化觀察15例正常膀胱組織標本、35例移行細胞癌組織標本以及體外培養(yǎng)膀胱癌細胞株BIU-87中Cx26表達情況.Cx26在所有膀胱移行上皮細胞中強表達,主要表達在細胞膜上,而在腫瘤

5、組織中,約68.3﹪表達降低或不表達,5例異常表達在胞漿或胞核上,Cx26在早期高分化腫瘤中表達降低,且隨腫瘤惡性程度增加有降低趨勢.在BIU-87細胞系中幾乎不表達.RT-PCR測6例正常移行上皮組織和6例腫瘤組織及BIU-87細胞的Cx26 m RNA,并行半定量分析,Cx26 m RNA水平在腫瘤組織和BIU-87細胞株中顯著降低(p<0.05).2、體外觀察全反式維甲酸對膀胱癌細胞株BIU-87生長抑制作用,劃痕標記染料示蹤技術(shù)

6、觀察ATRA不同濃度不同時相細胞間通訊功能的變化,同時行免疫組化和RT-PCR 觀察Cx26表達的改變.結(jié)果ATRA 顯著抑制細胞生長,促進凋亡,增加連接蛋白Cx26的表達,改善細胞間通訊功能,隨劑量增加而增強,呈劑量相關(guān)性.3、觀察全反式維甲酸處理后的BIU-87細胞對HSV-TK/GCV殺傷作用的敏感性:把BIU-87-TK(+)和BIU-87-TK(-)細胞按不同比例混合培養(yǎng)(BIU-87-TK陽性細胞占總細胞的比例分別為0.1、

7、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0),MTT法觀測ATRA對TK基因旁觀者殺傷作用的影響,結(jié)果經(jīng)ATRA處理后顯著提高TK基因的旁觀者殺傷作用(p<0.05),尤其當陽性細胞比例為0.4、0.6時最顯著.結(jié)論:在膀胱移行細胞癌中縫隙連接蛋白Cx26表達降低或異常分布,可能是導致細胞間連接通訊功能下降的主要原因,且與腫瘤惡性生物學有密切關(guān)系.ATRA可以顯著提高HSV-TK對膀胱癌BIU-87細胞的旁觀者殺傷作用,可能與通過促進腫瘤細