補(bǔ)腎法、疏肝法對促性腺激素預(yù)處理小鼠排卵機(jī)制影響的比較研究.pdf

1、一、補(bǔ)腎法、疏肝法對促性腺激素預(yù)處理小鼠排卵數(shù)目的影響
　　 目的：研究補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方、Ⅲ號方、逍遙丸對促性腺激素預(yù)處理小鼠排卵數(shù)目的影響，以探討并比較補(bǔ)腎法、疏肝法誘發(fā)排卵的機(jī)制。
　　 方法：雌性未成年昆明小鼠102只，隨機(jī)分為17組，每組6只。其中1-4組為補(bǔ)腎法組，5-8組為疏肝法組，9-12組為補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方+逍遙丸組，13-16組為逍遙丸+補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方組，17組為對照組。實驗第1、2、3天，除對照組外，補(bǔ)腎

2、法組和補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方+逍遙丸組、疏肝法組和逍遙丸+補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方組，每只小鼠分別灌胃Ⅱ號方（高劑量或低劑量）、逍遙丸（高劑量或低劑量）0.4ml，共3天。實驗第3天13:00所有小鼠均腹腔注射PMSG(5IU/只)；實驗第4、5天補(bǔ)腎法組和補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方+逍遙丸組、疏肝法組和逍遙丸+補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方組，每只小鼠分別灌胃Ⅲ號方（高劑量或低劑量）、逍遙丸（高劑量或低劑量）0.4ml共2天；第5天13:00各組小鼠均腹腔注射hCG(5IU/只)

3、。第6天上午8:00處死小鼠，取輸卵管、卵巢，體式顯微鏡下刺破輸卵管壺腹部，計數(shù)卵子數(shù)。
　　 結(jié)果：單因素方差分析：與對照組比較，補(bǔ)腎法以補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方高劑量與Ⅲ號方高劑量序貫使用排卵數(shù)目多（P=0.003）；疏肝法以逍遙丸高劑量促進(jìn)卵泡發(fā)育、逍遙丸低劑量誘發(fā)排卵序貫使用排卵數(shù)目多（P=0.007）。析因設(shè)計分析：補(bǔ)腎法促排卵使用補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方高劑量與低劑量有顯著差異（P=0.004），Ⅱ號方、Ⅲ號方高劑量序貫使用排卵數(shù)目多，

4、二者有交互作用(P=0.047)。疏肝法促排卵使用逍遙丸高、低劑量有顯著差異（P=0.039），序貫應(yīng)用高、低劑量排卵數(shù)目最多，二者有交互作用(P=0.046)。單因素方差分析：與對照組比較，逍遙丸+補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方組中逍遙丸低劑量與Ⅲ號方高劑量序貫使用排卵數(shù)增多(P=0.013)，析因設(shè)計分析二者無交互作用（P=0.838）；單因素方差分析：與對照組比較，Ⅱ號方高劑量與逍遙丸低劑量序貫使用排卵數(shù)多（P=0.039），析因設(shè)計分析二者無交

5、互作用(P=0.604)。
　　 結(jié)論：對促性腺激素預(yù)處理小鼠序貫使用補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方、Ⅲ號方高劑量卵巢排卵數(shù)目多，與陰精盛助卵泡發(fā)育、陽氣足使陰陽轉(zhuǎn)化順利有關(guān)；逍遙丸高、低劑量序貫使用排卵數(shù)目多，與血足精充促卵泡發(fā)育、疏肝理氣助陰陽轉(zhuǎn)化順利有關(guān)。兩法均有交互作用，即序貫使用可提高藥物療效。
　　 二、補(bǔ)腎法、疏肝法對促性腺激素預(yù)處理小鼠卵巢COX-2、PTX3、TSG-6影響的比較
　　 目的：研究補(bǔ)腎法、疏肝法

6、對促性腺激素預(yù)處理小鼠卵巢COX-2以及透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白PTX3、TSG-6表達(dá)的影響，以探討兩法對卵丘膨脹的影響而誘發(fā)排卵的機(jī)制及其異同。
　　 方法：將雌性昆明種未成年小鼠96只隨機(jī)分為正常組、對照組、補(bǔ)腎組、疏肝組，每組24只。實驗第1、2、3天，補(bǔ)腎組、疏肝組小鼠分別灌服補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方高劑量、逍遙丸高劑量，對照組、正常組灌服蒸餾水，共3天；實驗第3天8:00，補(bǔ)腎組、疏肝組、對照組小鼠腹腔注射PMSG(5IU/只)，48

7、h后腹腔注射hCG(5IU/只)，正常組在相同時間注射等體積生理鹽水；實驗第4、5天，補(bǔ)腎組、疏肝組小鼠分別灌服補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方高劑量、逍遙丸低劑量，對照組、正常組灌服蒸餾水，共2天。灌胃劑量均為0.4m1/只。各組小鼠均在注射hCG后0、4、8、12h處死，取雙側(cè)卵巢，液氮保存?zhèn)錂z。RT-PCR檢測COX-2、PTX-3mRNA在卵巢的表達(dá)，免疫組化法檢測COX-2、TSG-6蛋白在卵巢的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1

8、各組促性腺激素預(yù)處理小鼠在注射hCG后0、4、8、12h卵巢COX-2mRNA及其蛋白的表達(dá)注射hCG后0、4、8h，各組小鼠卵巢COX-2表達(dá)呈升高趨勢，12h均下降。注射hCG后0h：與對照組比較，疏肝組、補(bǔ)腎組小鼠卵巢COX-2表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組小鼠卵巢COX-2表達(dá)下降但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。注射hCG后4h：與對照組比較，疏肝組和補(bǔ)腎組小鼠卵巢COX-2表達(dá)均下降，有統(tǒng)計學(xué)意義

9、(均P＜0.05)。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組小鼠卵巢COX-2表達(dá)下降但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。注射hCG后8h：與對照組比較，疏肝組小鼠卵巢COX-2表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；補(bǔ)腎組小鼠卵巢COX-2表達(dá)降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組小鼠卵巢COX-2表達(dá)降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。注射hCG后12h：與對照組比較，疏肝組小鼠卵巢COX-2表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；補(bǔ)腎組

10、小鼠卵巢COX-2無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組小鼠卵巢COX-2表達(dá)降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2 各組促性腺激素預(yù)處理小鼠在注射hCG后0、4、8、12h卵巢TSG-6蛋白的表達(dá)各時間點對照組小鼠卵巢TSG-6蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，各時間點間比較，除4h、8h之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)外其余時間點間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。疏肝組各時間點小鼠卵巢TSG-6蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，各時

11、間點之間比較，除8h、12h之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)外其余時間點間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。補(bǔ)腎組各時間點小鼠卵巢TSG-6蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，各時間點之間比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。注射hCG后0h：與對照組比較，疏肝組、補(bǔ)腎組小鼠卵巢TSG-6蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。注射hCG后4h：與對照組比較，疏肝組、補(bǔ)腎組小鼠卵巢TSG-6蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組小鼠卵

12、巢TSG-6蛋白表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。注射hCG后8h：與對照組比較，疏肝組、補(bǔ)腎組小鼠卵巢TSG-6蛋白表達(dá)均增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組小鼠卵巢TSG-6蛋白表達(dá)降低，無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。注射hCG后12h:與對照組比較，疏肝組、補(bǔ)腎組小鼠卵巢TSG-6蛋白表達(dá)均增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組小鼠卵巢TSG-6蛋白表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義(

13、P＜0.01)。
　　 3 各組促性腺激素預(yù)處理小鼠在注射hCG后0、4、8、12h卵巢PTX-3mRNA的表達(dá)注射hCG后0、4、8h，對照組小鼠卵巢PTX3mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，各組之間均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；注射hCG后12h，小鼠卵巢PTX3mRNA表達(dá)降低，與注射hCG后8h比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。注射hCG后0、4h：與對照組比較，疏肝組、補(bǔ)腎組小鼠卵巢PTX3mRNA表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0

14、.01)。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組小鼠卵巢PTX3mRNA表達(dá)降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。注射hCG后8h：與對照組比較，疏肝組、補(bǔ)腎組小鼠卵巢PTX3mRNA的表達(dá)降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組小鼠卵巢PTX3mRNA表達(dá)降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。注射hCG后12h：與對照組比較，疏肝組、補(bǔ)腎組小鼠卵巢PTX3mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組小鼠卵巢PTX3

15、mRNA表達(dá)降低，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：補(bǔ)腎法、疏肝法對促性腺激素預(yù)處理小鼠排卵前卵巢COX-2mRNA及其蛋白的作用機(jī)制不同，疏肝法主要上調(diào)卵巢COX-2mRNA及其蛋白的表達(dá)，補(bǔ)腎法主要是下調(diào)卵巢COX-2mRNA及其蛋白的表達(dá)。補(bǔ)腎法、疏肝法對卵巢TSG-6、PTX3作用機(jī)制相似，均可上調(diào)排卵前卵巢TSG-6蛋白、PTX3mRNA的表達(dá)，從而促進(jìn)了卵丘細(xì)胞外基質(zhì)形成，使卵丘充分膨脹有利于排卵。疏肝法、

16、補(bǔ)腎法上調(diào)TSG-6蛋白的表達(dá)可能是使排卵數(shù)目增多的原因之一。
　　 三、補(bǔ)腎法、疏肝法對促性腺激素預(yù)處理小鼠卵巢ADAMTS-1、CatL影響的比較
　　 目的：研究補(bǔ)腎法、疏肝法對促性腺激素預(yù)處理小鼠卵巢ADAMTS-1、CatLmRNA及其蛋白表達(dá)的影響，以探討兩種治法對排卵過程中促使卵泡壁破裂機(jī)制的排卵機(jī)制的異同。
　　 方法：動物分組及取材同第二部分。RT-PCR檢測卵巢ADAMTS-1、CatLmRN

17、A的表達(dá)，Western blot檢測卵巢ADAMTS-1、CatL蛋白的表達(dá)，免疫組化檢測卵巢PR、ADAMTS-1、CatL蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1 各組促性腺激素預(yù)處理小鼠在注射hCG后0、4、8、12h卵巢PR蛋白的表達(dá)注射hCG后0h、8h、12h，與對照組比較，疏肝組、補(bǔ)腎組小鼠卵巢PR蛋白表達(dá)均增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。注射hCG4h，與對照組比較，疏肝組、補(bǔ)腎組小鼠卵巢PR蛋白表達(dá)均

18、無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。疏肝組與補(bǔ)腎組之間在4個時間點比較，小鼠卵巢PR蛋白表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 2 各組促性腺激素預(yù)處理小鼠在注射hCG后0、4、8、12h卵巢ADAMTS-1mRNA及其蛋白的表達(dá)4個時間點各組小鼠卵巢ADAMTS-1表達(dá)呈上升趨勢，12h達(dá)高峰。注射hCG后0h：各組小鼠卵巢ADAMTS-1表達(dá)不明顯。注射hCG后4h：與對照組比較，疏肝組、補(bǔ)腎組小鼠卵巢ADAMTS-1表達(dá)增強(qiáng)

19、，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組小鼠卵巢ADAMTS-1表達(dá)降低但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。注射hCG后8h：與對照組比較，疏肝組小鼠卵巢ADAMTS-1表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；補(bǔ)腎組小鼠卵巢ADAMTS-1表達(dá)降低但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組小鼠卵巢ADAMTS-1表達(dá)降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。注射hCG后12h：與對照組比較，疏肝組小鼠卵巢ADA

20、MTS-1表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；補(bǔ)腎組卵巢ADAMTS-1表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組小鼠卵巢ADAMTS-1表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 3 各組促性腺激素預(yù)處理小鼠在注射hCG后0、4、8、12h卵巢CatLmRNA及其蛋白的表達(dá)4個時間點各組小鼠卵巢CatL表達(dá)呈上升趨勢，12h達(dá)高峰。注射hCG后0h：各組小鼠卵巢CatL表達(dá)均不明顯。注射hCG后4h：與對照

21、組比較，疏肝組、補(bǔ)腎組小鼠卵巢CatL表達(dá)均增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組小鼠卵巢CatL表達(dá)較低但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。注射hCG后8h：與對照組比較，疏肝組小鼠卵巢CatL表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；補(bǔ)腎組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組小鼠卵巢CaL表達(dá)降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。注射hCG后12h：與對照組比較，疏肝組小鼠卵巢CatL表達(dá)增強(qiáng)但無統(tǒng)計學(xué)差異（

22、P＞0.05）；補(bǔ)腎組小鼠卵巢CatL表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與疏肝組比較，補(bǔ)腎組小鼠卵巢CatL表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.015)。
　　 結(jié)論：補(bǔ)腎法、疏肝法均可上調(diào)促性腺激素預(yù)處理小鼠排卵前卵巢PR蛋白的表達(dá)，在注射hCG后12h，補(bǔ)腎法上調(diào)PR蛋白表達(dá)的作用較疏肝法強(qiáng)。補(bǔ)腎法、疏肝法均可上調(diào)促性腺預(yù)處理小鼠卵巢排卵關(guān)鍵蛋白水解酶ADAMTS-1、CatLmRNA及其蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了排卵斑的形成、卵