hTERT啟動子調控TRAIL基因表達載體誘導宮頸癌細胞凋亡的研究.pdf

1、宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一。近年來，隨著社會生活的變化，宮頸癌發(fā)病的年輕化和腺癌比例增加等都給宮頸癌的診治提出了新的問題和面臨著新的挑戰(zhàn)。為此，人們致力于探索提高宮頸癌治療效果的方法。 hTERT (human telmoerase reserse transcriptase)是人端粒酶活性的中心，是最重要、最普遍的腫瘤特異性的生化標志之一。端粒酶的活化是細胞永生化和癌變的重要因素。TRAIL (Tumor necrosi

2、s factor related apoptosis-inducingligand)是腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體，能選擇性介導腫瘤細胞凋亡而對正常組織和細胞無損傷，其抗腫瘤的優(yōu)勢已受到研究者的廣泛重視。本實驗旨在探討端粒酶（hTERT）啟動子驅動的腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）對宮頸癌細胞的生長抑制作用，以及與放化療聯合在避免損傷正常細胞，靶向腫瘤及提高特異性治療中的作用。 目的: 探討腫瘤壞死因子相關配體

3、（TRAIL）在宮頸癌組織的表達情況；探討hTERT 啟動子調控TRAIL 的基因表達載體對宮頸癌細胞株HeLa 和SiHa 的生長抑制，對細胞生長周期、細胞凋亡等生物學行為的影響；觀察聯合放化療對細胞的生長抑制、誘導凋亡的作用以及對細胞成瘤性的影響，進一步探討hTERT 啟動子調控TRAIL 與宮頸癌的關系，為宮頸癌的治療及預后提供實驗依據。 方法: 1.應用免疫組織化學方法（SABC），檢測49 例宮頸癌組織、10

4、例宮頸上皮內瘤變中TRAIL 和死亡受體DR4、DR5 的表達，及其與宮頸癌的病理分級、臨床分期和淋巴結轉移的關系。 2. 用脂質體法轉染真核基因表達載體hTERTpromoter-pIRES2-EGFP 和CMVpromoter-pIRES2-EGFP 等,G418 篩選，將穩(wěn)定轉染的各組細胞組RT-PCR檢測TRAILmRNA 的表達情況；免疫熒光顯微鏡觀察轉染細胞中綠色熒光蛋白GFP/TRAIL 的表達情況；流式細胞術檢測

5、轉染真核表達載體hTERT-TRAIL 和CMV-TRAIL 對細胞凋亡的作用； MTT 法觀察轉染真核基因表達載體hTERT-TRAIL 和CMV-TRAIL 對細胞增殖能力的影響；透射電子顯微鏡觀察轉染hTERT -TRAIL 細胞的超微結構改變。 3．采用MTT 法，觀察轉染組細胞對化療藥物順鉑的敏感性及對細胞增殖能力的影響；流式細胞術分析聯合化療藥物對轉染組細胞的凋亡和細胞周期的作用。 4．分別用MTT、流式細胞

6、術觀察轉染hTERT-TRAIL 聯合放化療后，對細胞生長抑制、細胞凋亡和細胞周期的影響；克隆形成能力實驗觀察轉染組細胞聯合放化療后克隆形成的情況。 5．用免疫組化法（SABC）檢測裸鼠移植瘤組織中TRAIL 的表達情況；觀察轉染真核基因表達載體hTERT-TRAIL 的HeLa 細胞裸鼠移植瘤成瘤情況及裸鼠生長情況，檢測聯合放化療后移植瘤終體積和質量的變化，抑瘤率的變化。 結果: 1.TRAIL 在宮頸癌組織中

7、呈現低表達，與宮頸上皮內瘤變、正常宮頸上皮組表達率三者比較有統計學意義(P <0.05)；在不同組織學類型鱗癌與腺癌的表達無統計學意義（P>0.05）;在淋巴結轉移組呈現低表達，有統計學意義（P<0.05）;死亡受體DR4、DR5 在宮頸癌組織高表達，有統計學意義（P<0.05）。 2. RT-PCR 檢測端粒酶啟動子調控TRAIL 基因表達載體TRAILmRNA 的表達強于其它組轉染細胞的表達（P<0.01）；流式細胞儀檢測轉

8、染hTERT-TRAIL 細胞凋亡率顯著上調（P<0.05），細胞的惡性增殖能力顯著降低（P<0.05）；免疫熒光顯微鏡檢測到在宮頸癌細胞株有特異性的綠色熒光蛋白GFP/TRAIL 的表達；透射電子顯微鏡觀察到端粒酶啟動子調控TRAIL 基因表達載體抑制宮頸癌細胞作用是以細胞凋亡為主。 3．端粒酶啟動子調控TRAIL 基因表達載體在體外能抑制宮頸癌細胞的生長，聯合化療增加了化療的敏感性；抑制作用有時間和劑量依賴性；流式細胞儀檢測

9、聯合化療后轉染hTERT-TRAIL 細胞凋亡率顯著上調（P<0.05），對細胞周期的影響以G1/G0 期細胞為主。 4．與化療組放療組相比較，聯合放化療后端粒酶啟動子調控TRAIL 基因表達載體在體外能明顯抑制宮頸癌細胞的生長(P<0.01)，誘導細胞的凋亡(P<0.01)，化療放療具有協同作用。 5. 免疫組化檢測結果顯示裸鼠移植瘤組織中有TRAIL 的表達；HeLa 裸鼠皮下移植瘤成瘤實驗表明：與化療組、放療組相比

10、較，聯合放化療端粒酶啟動子調控TRAIL 基因表達載體抑制了宮頸癌細胞HeLa 裸鼠移植瘤的生長，其抑瘤率亦明顯增加（P<0.05）。 結論: 1. 宮頸癌組織中TRAIL 表達下降，與腫瘤的分化、轉移密切相關。宮頸癌組織中死亡受體DR4、DR5 表達增高，與細胞分化相關。 2. hTERT 調控的TRAIL 可能通過提高宮頸癌細胞株HeLa 和SiHa 對TRAIL 的敏感性，引起宮頸癌細胞株的增殖能力下降,促

11、進細胞的凋亡。 3. hTERT 調控的TRAIL 聯合化療對宮頸癌細胞株HeLa 有明顯抑制細胞生長、誘導細胞凋亡的作用，同時增加了細胞對化療的敏感性。 4. 裸鼠成瘤性實驗表明: hTERT–TRAIL 對宮頸癌細胞HeLa 裸鼠移植瘤的生長有抑制作用，移植瘤質量的抑瘤率提高。 5. 與單純放化療比較, 聯合放化療的轉染真核基因表達載體hTERT-TRAIL 組細胞對宮頸癌細胞株HeLa 在體內和體外都有明顯