HCN2基因轉染骨髓間充質(zhì)干細胞體外構建生物起搏器的實驗研究.pdf

1、目的： 心臟和神經(jīng)系統(tǒng)的節(jié)律性活動均依賴于一種能產(chǎn)生起搏電流的細胞,其起搏活動特點是存在起搏電流If。進來的研究證實If在調(diào)控心臟和神經(jīng)元的自發(fā)搏動中起著非常重要的作用,在目前以基因治療和細胞移植技術治療緩慢型心律失常疾病的研究中,If離子通道基因(HCN)備受重視。本課題采用HCN2重組腺病毒載體轉染傳代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞的方法,構建具有自動起搏功能的生物起搏器。 方法： 1、骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和

2、鑒定： 采用Pereoll密度梯度分離和貼壁相結合的方法分離pBMSCs后,培養(yǎng)于含20％FBS的DMEM培養(yǎng)基,并傳代培養(yǎng)；觀察培養(yǎng)細胞的生長狀態(tài)；通過CD34、CD44、CD45、CD71、VⅢ因子及desmin的免疫組織化學和流式細胞技術進行細胞成份鑒定。應用VEGF體外誘導,觀察pBMSCs的多向分化的功能特性。 2、重組腺病毒載體Ad.HCN2的構建及其檢測： 應用陽離子脂質(zhì)體轉染法制備Ad.HCN2重

3、組腺病毒,將鑒定正確的重組腺病毒進行擴增、純化和滴度測定。用HeLa細胞檢測是否有野生型腺病毒產(chǎn)生；以GFP為信號基因,確定最佳MOI;繪制Ad.GFP轉染pBMSCs表達強度的時間曲線；流式細胞檢測Ad.HCN2轉染pBMSCs的細胞活力及細胞周期的變化；繪制Ad.HCN2、Ad.Null分別轉染pBMSCs以及未轉染的pBMSCs的生長曲線。 3、重組腺病毒Ad.HCN2轉染pBMSCs構建生物起搏器的功能鑒定： 以

4、Ad.HCN2轉染pBMSCs作為實驗組,Ad.Null轉染作為陰性對照組,未轉染pBMSCs作為空白對照組。用逆轉錄多聚酶鏈反應、免疫熒光染色染色、流式細胞技術、免疫印跡雜交、膜片鉗分別檢測各組的HCN2的mRNA、通道蛋白的表達以及HCN2通道的電生理學特性；將各組細胞與乳鼠心肌細胞聯(lián)合培養(yǎng)后,觀察乳鼠心肌細胞收縮頻率變化。 結果： 1、pBMSCs的形態(tài)、表面標記、生長曲線及多向分化潛能經(jīng)形態(tài)學觀察和免疫組織化學檢

5、測,顯示所培養(yǎng)細胞呈成纖維細胞樣形態(tài),免疫化學染色CD44、CD71陽性,CD34、CD45陰性、desmin、VⅢ因子免疫組織化學陰性,符合pBMSCs的形態(tài)和表面標記；流式細胞儀分析,CD44、CD71陽性細胞分別占76.27％、85.36％,體外經(jīng)VEGF誘導后,免疫組織化學鑒定pBMSCs的CD34表面標記轉為陽性,說明pBMSCs向內(nèi)皮系分化,其具有多向分化能力。 2、重組腺病毒Ad.HCN2的構建成功制備Ad.HCN

6、2重組腺病毒經(jīng)濃縮、純化,用HeLa細胞檢測沒有發(fā)現(xiàn)有野生型腺病毒產(chǎn)生。以Ad.GFP轉染pBMSCs確定MOI=50為最佳感染復數(shù)；Ad.GFP轉染pBMSCs后的表達強度至一周后下降,可持續(xù)表達1月以上：轉染Ad.HCN2對pBMSCs的細胞活力和細胞周期無明顯變化；Ad.HCN2、.Ad.Null轉染和未轉染的pBMSCs的生長曲線比較無明顯差異。 3、生物起搏器的功能鑒定逆轉錄多聚酶鏈反應檢測提示實驗組HCN2mRNA水

7、平高于對照組。免疫熒光染色檢測可見實驗組細胞膜染色,流式細胞技術,免疫印跡雜交均提示轉染細胞有HCN2蛋白的表達,而對照組無陽性發(fā)現(xiàn)。轉染HCN2的豬骨髓間充質(zhì)干細胞電生理學特點：給予超極化刺激時,實驗組可記錄到超極化激活的內(nèi)向電流即If,其激活電位約為-60mY,完全激活電位-140mV,呈電壓依賴性。細胞外給予低濃度的Cs+(4mmol/L),內(nèi)向的If被明顯抑制。對照組未見If電流。在實驗組與乳鼠心肌細胞(NRCs)聯(lián)合培養(yǎng)后可見

8、NRCs收縮,培養(yǎng)液中滴入異丙腎上腺素可見細胞收縮頻率增快,陰性及空白對照組中無陽性發(fā)現(xiàn)。 結論： 1、采用Percoll密度梯度和貼壁相結合的方法,可分離獲得較高純度的pBMSCs。pBMSCs體外增殖速度快,可短期內(nèi)達到實驗所需要細胞數(shù)量。 2、Ad.HCN2可以安全、有效的轉染pBMSCs構建生物起搏器,其表達強度隨細胞增殖略有下降。以腺病毒為載體進行的基因轉染對pBMSCs生長無明顯影響。 3、實