腦淋巴引流阻滯對SAH繼發(fā)性腦缺血損傷的影響及吡哆醇的緩解作用.pdf

1、研究背景： 急性腦血管病是人類三大致死性疾病之一，其中蛛網膜下腔出血(subarachnoidhemorrhage，SAH) 的發(fā)病率僅次于腦梗塞和腦出血，位居第三位。絕大多數 SAH 系腦動脈瘤破裂所致，其病死率高達25％以上，存活下來的患者約1/3因神經功能缺損而需依賴他人生活，給社會和家庭帶來沉重負擔。再出血和繼發(fā)腦缺血是導致 SAH患者嚴重預后的兩個主要并發(fā)癥。目前對腦動脈瘤的閉塞術和血管內栓塞術取得了很大的進步，SAH

2、 后再出血率已顯著降低，但其總體預后并沒有顯著改善。因此，深入探討SAH后繼發(fā)腦缺血損傷的機制，尋找有效防治措施是改善SAH預后的關鍵環(huán)節(jié)，具有十分重要的現(xiàn)實意義。 數十年來，SAH 后腦部主要動脈血管發(fā)生的痙攣和管腔狹窄，即所謂腦血管痙攣 (cerebral vasospasm，CVS) 一直是研究的焦點問題。近年來發(fā)現(xiàn)SAH 后 CVS 出現(xiàn)的時程和嚴重程度與繼發(fā)性腦缺血損傷并不呈完全平行的關系，除CVS外，SAH后腦微血管

3、痙攣和微循環(huán)調節(jié)功能異常等因素也與繼發(fā)性腦缺血的發(fā)生有關。神經元的死亡可通過壞死(necrosis)和凋亡(apoptosis)兩種不同形式發(fā)生。哺乳動物細胞凋亡是受 Bcl-2蛋白家族、凋亡蛋白活化因子 1(apoptosis protein activating factor,Apaf-1)、caspase(胱冬肽酶)蛋白家族等調控的。caspase 家族成員歸居于不同的凋亡通路，其中 caspase-3 與凋亡密切相關。在線粒體對

4、細胞凋亡的調控中，Bcl-2 家族的蛋白質對線粒體內一些促凋亡因子的釋放具有調控功能，因此在決定細胞生死中也具有十分重要的作用。通過大分子物質示蹤等技術在不同種屬動物包括人類的研究已經證實，腦內和蛛網膜下腔中的大分子物質可以被引流入顱外淋巴管和淋巴結。吡哆醇為維生素 B 族化合物，是機體內一種重要輔酶，它以 5′-磷酸吡哆醛的形式參與了氨基酸、脂類等代謝和免疫反應等過程。臨床上對淋巴滯留性腦病患者采用大劑量吡哆醇或泛酸治療能明顯減輕患者

5、癥狀，說明吡哆醇能夠改善大分子物質引流，但其機理不清。SAH繼發(fā)腦缺血發(fā)生后，大量血漿蛋白等大分子物質可通過受損的血腦屏障進入腦組織中；由細胞受損而產生的細胞裂解產物和缺血代謝瀑布產生的大量肽類等大分子物質在腦組織中急劇增加。上述大分子物質在腦組織中的積聚直接使神經細胞進一步受損，或通過腦組織滲透壓升高而引起腦水腫甚至腦疝，導致患者神經功能缺損乃至死亡。這些在蛛網膜下腔和腦組織內積聚的大分子物質被清除的程度如何，將對 SAH的最終結局產

6、生極為重要的影響。然而，目前國內外其他學者對SAH繼發(fā)腦缺血損傷的研究尚沒有涉及大分子物質清除這一重要問題。 研究目的： 1、進一步闡明腦淋巴引流途徑在病理條件下腦組織大分子物質引流和維持腦組織內環(huán)境穩(wěn)定中的重要作用。 2、明確SAH后腦淋巴引流途徑變化特征，闡明腦淋巴引流途徑在SAH繼發(fā)腦缺血損傷中起到的內源性保護作用。 3、從改善腦內物質的淋巴引流角度尋找有效防治SAH繼發(fā)腦缺血損傷的藥物。

7、研究方法： 1、選用健康成年 Wistar大鼠，雌雄不拘，隨機分為正常對照組、SAH 組、SAH+CLB 組、SAH+CLB+ 吡哆醇組、SAH+CLB+ 生理鹽水組。采用頸淋巴管結扎和淋巴結摘除法制作大鼠腦淋巴引流阻滯(CLB)模型，應用枕大池二次注血法建立大鼠SAH模型。于模型制作結束后12h內，監(jiān)測有關生理指標等變化。于第二次注血后48h在體觀察基底動脈(BA)管徑變化，測定BA對乙酰膽堿(Ach)的反應性，同時行組織病理

8、學觀察基底動脈形態(tài)和管徑，并對腦膜微循環(huán)的動態(tài)變化進行觀察。 2、對上述分組動物，于術后48h，HE染色觀察大腦皮層和海馬的形態(tài)結構變化；PI 染色觀察大腦皮層和海馬細胞核的形態(tài)結構變化，采用TUNEL 熒光標記法檢測大腦皮層和海馬原位凋亡。取新鮮大腦皮層和海馬，采用SABC免疫熒光技術檢測caspase-3 和 Bcl-2 的蛋白表達；利用RT-PCR技術檢測 caspase-3 和Bcl-2的mRNA表達。 研究結果

9、： 1、腦池注血的動物除血壓一過性升高外，動脈血氣等生理指標維持在正常范圍內；SAH 組、SAH+CLB 組、SAH+CLB+生理鹽水組出現(xiàn)ICP升高和腦灌注壓(CPP)下降；BA 管腔明顯痙攣縮窄，管壁增厚，且對Ach反應性降低；腦膜微動、靜脈明顯痙攣，血流多呈泥沙樣流動，甚至可見血流郁滯、擺動等明顯異常，以 SAH+CLB組、SAH+CLB+溶媒組更為嚴重。吡哆醇可減輕CLB對SAH所致ICP升高、CPP下降、BA 痙攣和腦

10、膜微循環(huán)異常的變化。 2、(1)HE染色可見SAH組大鼠部分神經元脫失，皺縮，核固縮、深染，SAH+CLB組腦組織及毛細血管壁明顯水腫，組織間隙增寬，內含大量水腫液，腦血管壁水腫，神經元分部稀疏，細胞皺縮、變形，核染色質致密濃縮、邊集，部分核碎裂，部分神經元周圍有空泡形成。吡哆醇組上述表現(xiàn)較SAH+CLB組有一定程度的減輕。(2)PI染色可見SAH組細胞部分凋亡，細胞核呈波紋狀或折縫樣，部分染色質出現(xiàn)濃縮狀態(tài)，個別細胞核的染色質

11、高度凝聚、邊緣化，呈新月形，SAH+CLB 組大鼠有大量細胞凋亡，且多屬于凋亡晚期：染色質高度凝聚、邊緣化，新月形，核碎裂，產生凋亡小體。吡哆醇組凋亡細胞明顯減少。(3) TUNEL 法原位細胞凋亡檢測顯示SAH組散在較多的 TUNEL 陽性細胞，SAH+CLB 組可見大量TUNEL陽性細胞，凋亡細胞多集中在大腦皮層、海馬、基底節(jié)區(qū)、脈絡叢、室管膜等部位，而以海馬、室管膜更為明顯。吡哆醇組可見散在 TUNEL 陽性細胞。(4)免疫熒光技

12、術檢測到SAH組有較多的 caspase-3 免疫陽性細胞，SAH+CLB組有大量caspase-3免疫陽性細胞分布，吡哆醇組 caspase-3 免疫陽性細胞表達較SAH+CLB組減少。SAH組可見較多的Bcl-2免疫陽性細胞，SAH+CLB組可見少量Bcl-2免疫陽性細胞分布，毗哆醇組 Bcl-2 免疫陽性細胞表達較SAH+CLB組明顯增多。(5)RT-PCR檢測結果顯示SAH組大腦皮層和海馬caspase-3基因mRNA表達明顯高

13、于正常對照組，SAH+CLB組caspase-3 基因mRNA表達更高，吡哆醇組caspase-3基因的mRNA表達則較 SAH+CLB 組明顯減少。SAH 組 Bcl-2 基因mRNA表達明顯低于正常對照組，SAH+CLB組Bcl-2基因mRNA 表達則更低，吡哆醇組caspase-3基因的mRNA表達則較SAH+CLB組明顯增高。 研究結論： 1、阻斷腦淋巴引流途徑可加重SAH后腦血管痙攣和基底動脈的病理變化。

14、 2、阻斷腦淋巴引流途徑可降低SAH后腦部微循環(huán)灌流量，加重微血管痙攣，降低腦微血管流速。 3、吡哆醇干預對腦淋巴引流阻斷所致的SAH后腦血管痙攣和微循環(huán)異常具有一定緩解作用。 4、阻斷腦淋巴引流途徑將加重SAH所致腦水腫。 5、阻斷腦淋巴引流途徑可以通過下調Bcl-2表達，上調caspase-3 表達來加重 SAH繼發(fā)性腦缺血損傷。 6、吡哆醇干預對腦淋巴引流阻斷所致的SAH繼發(fā)性腦缺血損傷具有一定緩