綠豆NBS-LRR類抗病基因克隆及其表達研究.pdf

1、綠豆是重要的農作物之一，綠豆中的某些成分有直接抑菌作用，抗病性極強。大豆不僅是人們的食用糧食，而且是飼料的重要來源，但是每年大豆產量因病害而大量減少，若是能從綠豆中克隆出抗病基因，再轉化大豆等農作物，增強大豆等經濟作物的抗病性，將減少農藥使用帶來的環(huán)境污染等副作用。通過植物抗病基因的克隆并且轉化大豆等農作物的研究，對于抗病育種和抗病機理的理解具有重要意義。
　　目前，已有不少植物抗病基因及抗病基因同源序列被分離出來，這些抗病基因都

2、各具特點，大多數具有NBS結構域，但是還沒有綠豆NBS抗病基因被克隆出來，雖然目前從各種植物中克隆了很多NBS類抗病基因及抗病基因同源序列，但基本沒有將其轉化，并對其具體功能進行驗證。
　　本研究通過克隆綠豆NBS-LRR類抗病基因同源序列，將其轉化煙草及大豆，初步研究了序列在煙草及大豆中的轉化情況，并對轉基因植株的抗病性做了初步檢測。本論文主要方法和結果如下：
　　1、根據已克隆植物NBS-LRR抗病類基因（RGAs）保守

3、序列設計引物，從野生綠豆基因組DNA中分離得到了3條同源序列片段FGV-1，FJV-2，FJV-3（GenBank登錄號分別為KF021265、KF661550、KF661551）。經BLAST分析表明，FGV-1，FJV-2，FJV-3與已報道的大豆、蕓豆、鷹嘴豆等植物的RGAs有較高的同源性。經過Blastp分析表明，FGV-1、FJV-2、FJV-3基因翻譯的氨基酸序列中含有植物抗病保守結構域NB-ARC，具有抗病基因NBS特征結

4、構域：p-loop環(huán)、激酶2α、激酶3α及HD，推測序列FGV-1、FJV-2、FJV-3可能是綠豆NBS類抗性基因的核心區(qū)域。系統進化分析表明，3條綠豆RGA序列可分為兩個不同的類群：TIR-NBS和non-TIR-NBS。
　　2、利用pFGC5941構建植物表達載體pFGC5941-FGV-1，通過酶切驗證、PCR檢測及測序表明載體構建成功。
　　3、利用農桿菌介導法將序列轉化煙草及大豆，PCR鑒定結果顯示，獲得pFG

5、C5941-FGV-1轉基因大豆植株27株，煙草20株，獲得轉基因大豆植株后代種子24顆，經抗除草劑檢測結果表明，序列已經成功轉入大豆及煙草。
　　4、提取轉基因大豆葉片RNA，利用RT-PCR檢測結果表明，外源FGV-1基因已經在大豆葉片中表達。
　　5、用煙草花葉病毒侵染轉基因及非轉基因煙草葉片，幾天后，非轉基因煙草葉片表現出花葉病病癥，而轉基因煙草葉片無明顯變化。結果表明，轉基因煙草葉片表現出一定的抗病性。