急性病毒性壞死病毒兩種功能基因的克隆、表達(dá)及功能分析.pdf

1、急性病毒性壞死病毒（acute viral necrosis virus, AVNV）是20世紀(jì)末導(dǎo)致我國(guó)北方沿海櫛孔扇貝大規(guī)模死亡的的重要致病病原。隨著AVNV的全基因組序列的測(cè)定完成，確定該病毒全基因組序列一共包含123個(gè)可能的開(kāi)放型閱讀框(open reading frames, ORF)，其中的44個(gè)開(kāi)放型閱讀框具有一定的結(jié)構(gòu)和功能。本論文通過(guò)基因克隆、原核表達(dá)、真核表達(dá)以及體外功能分析等技術(shù)研究其中兩種功能基因的功能，這對(duì)了解

2、AVNV的侵染機(jī)制和致病機(jī)理，從而為AVNV的防控提供有效理論依據(jù)。
　　研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　第一部分：通過(guò)基因克隆技術(shù)得到了AVNV ORF86編碼的桿狀病毒凋亡抑制蛋白基因（IAP-86），將IAP-86基因與pET32a（+）質(zhì)粒連接構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pET32a-IAP86，之后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 E.coil BL21（DE3）中，使用終濃度0.1％的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，SD

3、S-PAGE檢測(cè)顯示表達(dá)蛋白分子量約為40ku，經(jīng)Western-blotting和質(zhì)譜分析證明該蛋白即為IAP-86融合蛋白，Co2+柱純化后得到了純化的的IAP-86融合蛋白。
　　第二部分：對(duì)原核表達(dá)得到的IAP-86蛋白進(jìn)行功能性分析，首先將重組的IAP-86蛋白用FITC標(biāo)記，熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)重組的IAP-86蛋白最終能夠與櫛孔扇貝血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)結(jié)合，提示重組的IAP-86蛋白能夠進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。

4、使用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒針對(duì) IAP-86的抗凋亡作用進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)重組的IAP-86蛋白能夠在一定程度上抑制櫛孔扇貝血淋巴細(xì)胞凋亡，凋亡抑制率在7%左右。
　　第三部分：為深入探討魁蚶中檢測(cè)到的急性病毒性壞死病毒（acute viral necrosis virus, AVNV）魁蚶株的致病機(jī)理以及進(jìn)一步研究IAP-86蛋白的功能，本實(shí)驗(yàn)從感染AVNV的瀕死魁蚶外套膜中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)NCBI公布的A

5、VNV全基因組序列中ORF86序列設(shè)計(jì)兩對(duì)反向套式引物，通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)獲得ORF865’端和3’端的非編碼區(qū)，拼接獲得全長(zhǎng)cDNA序列。Blast序列比對(duì)顯示，該基因與牡蠣皰疹病毒的相似性為100%，與櫛孔扇貝AVNV的相似性為99%，并存在重疊基因。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)該蛋白不含有信號(hào)肽，不存在跨膜區(qū)，最大疏水指數(shù)為1.800，最小疏水指數(shù)為-3.456。存在8個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)（包括5個(gè)絲氨酸、1個(gè)蘇氨酸和2

6、個(gè)酪氨酸），存在1個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)，不存在潛在的N-糖基化位點(diǎn)；其抗原表位主要集中在8-11、14-16、28-39、75-76、88-95、97-100和147-158位氨基酸。
　　第四部分：在使用原核表達(dá)技術(shù)對(duì)AVNV解旋酶進(jìn)行表達(dá)未獲得成功的前提下，嘗試使用酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)AVNV解旋酶進(jìn)行真核表達(dá)，本部分通過(guò)基因克隆技術(shù)獲得了表達(dá) AVNV解旋酶的開(kāi)放閱讀框-ORF66，并將該基因連接到 pPIC9K表達(dá)載體上，構(gòu)建