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文檔簡介
1、豬的體細胞核移植(克隆)技術在種質(zhì)資源保護、良種繁育,人類器官移植異種供體和疾病模型制備、輔助生殖技術質(zhì)控、藥物蛋白生產(chǎn),以及生殖與發(fā)育基礎研究等方面的成功應用,顯示出其在畜牧業(yè)、醫(yī)學和生物學等方面具有廣闊的應用前景。然而,由供體細胞核表觀遺傳重編程不徹底等因素所導致的豬體細胞克隆效率低下,極大地限制了該技術的進一步推廣。表觀遺傳學事件主要包括DN A甲基化和組蛋白修飾,其中后者又包括組蛋白的甲基化、乙酰化、糖基化、磷酸化、泛素化和SU
2、MO化等。研究顯示,利用恰當?shù)腄N A甲基化/去甲基化表觀遺傳修飾劑處理供核細胞或者克隆胚胎,可顯著改善重編程并提高克隆效率。借助 H3K79甲基轉(zhuǎn)移酶 DOT1L特異性抑制劑 EPZ004777(EPZ)干預,可促進小鼠誘導多能干細胞的獲取效率及質(zhì)量提高,表明 H3K79二甲基化(H3K79me2)可能參與調(diào)控細胞多能性。那么,H3K79me2是否參與了著床前克隆胚發(fā)育調(diào)控目前未見報道。因此,本研究以豬為研究對象,首先試圖揭示豬 H3
3、K79me2在豬克隆胚早期發(fā)育期間的動態(tài)變化,再結合EPZ處理,探討表觀修飾劑干預 H3K79me2重編程對豬克隆胚發(fā)育的影響,為今后最終闡明 H3K79me2參與細胞發(fā)育命運調(diào)控的分子機制提供依據(jù)。具體試驗和結果如下:
試驗一旨在揭示豬胚胎著床前發(fā)育期間 H3K79me2的重編程規(guī)律。以相應發(fā)育時期的豬體外受精胚胎(in vitrofertilization, IVF)為對照,利用H3K79me2抗體的間接免疫熒光技術,檢測
4、了不同發(fā)育階段的豬體細胞克隆(SCNT)胚胎中 H3K79me2的信號變化。結果發(fā)現(xiàn),在豬IVF和SCNT胚胎中,H3K79me2信號均在起點到原核胚期間從較高水平顯著降低至消失,至桑椹胚信號重新出現(xiàn),囊胚期進一步增強。所不同的是,在IVF胚胎中EXPB到HB階段H3K79me2表達水平趨于平緩,而在SCNT胚胎中從 EXPB到 HB階段 H3K79me2表達水平依然持續(xù)上升。另外,從原核期(16hpa NTE和18hpi IVFE)至
5、8-cell階段,H3K79me2在兩種胚胎中的信號均降至最低點,而在起始階段和桑椹胚之后IVFE中的H3K79me2信號水平均高于NTE。結果表明,豬體細胞克隆胚著床前發(fā)育期間H3K79me2重編程異常。
試驗二目的是探討EPZ對豬SCNT胚胎著床前體外發(fā)育的影響,將SCNT胚隨機置于分別添加0.5nM、5nM、50nMEPZ的PZM-3和1‰ DMSO(v/v)的PZM-3(對照組)自化學激活起處理24 h,根據(jù)各組胚胎的
6、卵裂率、囊胚率及囊胚總細胞數(shù)來評價其效果。結果發(fā)現(xiàn):各組卵裂率無差異;0.5nM組囊胚率顯著高于對照組(28.97±2.65% vs.17.13±2.69%);就囊胚總細胞數(shù)而言,各組均無明顯變化,但50nM組有降低的趨勢。隨后,選取含0.5nM EPZ的PZM-3,自化學激活起,分別孵育豬克隆胚胎12h、24h、36h(對照組處理0h)。結果顯示,各組卵裂率無顯著差異,而12h和24h處理組的囊胚率均顯著提高(28.56±3.51%,
7、28.34±3.00% vs.16.32±1.93%,17.93±0.64%)。在囊胚總細胞數(shù)上,除36 h處理組顯著降低外,其余三組之間無差異。以上結果說明,0.5nM EPZ處理12-24h可改善豬克隆胚胎的早期發(fā)育,而處理濃度過高或時間過長都可能損害胚胎發(fā)育。
試驗三旨在探明EPZ是否是通過調(diào)節(jié) H3K79me2重編程,進而有助于豬SCNT胚胎原核期H3K79me2重編程。以IVF胚胎和未經(jīng)EPZ處理的各期SCNT胚胎為
8、對照,在0.5nM EPZ處理后,檢測了1-細胞發(fā)育不同時期的SCNT胚胎其H3K79me2變化,以及處理4 h后重構胚 DOT1L基因的表達變化。結果發(fā)現(xiàn),IVF胚胎中,H3K79me2水平在受精后4h內(nèi)迅速降低,6hpi進一步降低,至10hpi信號消失;對照組H3K79me2的水平從電刺激活至4hpa階段緩慢降低,到8hpa信號消失;而經(jīng)EPZ處理組胚胎H3K79me2水平則從2hpa開始降低,4hpa繼續(xù)下降,至8hpa信號消失。
9、DOT1L基因在0.5nM EPZ處理組中表達量較對照組有所降低,但不顯著。結果表明,0.5nM EPZ處理部分抑制了DOT1L基因的表達,進而下調(diào)H3K79me2水平,改善了SCNT胚胎的H3K79重編程,從而有助于克隆胚的著床前發(fā)育。
試驗四的目的是進一步明晰EPZ促進豬SCNT胚胎體外發(fā)育的可能分子機制。檢測了0.5nM EPZ處理12h和24h后發(fā)育而來的豬SCNT囊胚不同時期(根據(jù)其形態(tài)分為EB、EXPB以及HB)
10、H3K79me2水平,與IVF囊胚、非EPZ處理的SCNT囊胚相應階段H3K79me2比較。結果發(fā)現(xiàn),經(jīng)EPZ處理后,SCNT囊胚中H3K79me2水平變化趨勢大體上與非EPZ處理的SCNT囊胚一致,雖然比非EZP組有所增加,但還達不到IVF囊胚的H3K79me2水平。之后檢測了EPZ處理12h、24h來源 SCNT囊胚及對照組 SCNT囊胚中相關基因(自我更新基因 OCT4、SOX2、LIN28以及分化基因CDX2、GATA4)的表達
11、。結果顯示,在源于EPZ處理的SCNT囊胚中,OCT4、CDX2和GATA4表達量均顯著上調(diào);SOX2在12h處理組中顯著高于對照組,24h組與對照組相比無明顯差異,Lin28則相反。兩處理組來源的囊胚,其CDX2和GATA4無差異;SOX2和LIN28在處理12h組中顯著高于24 h組,OCT4則相反。
綜上所述,本文首次對豬SCNT和IVF胚胎著床前發(fā)育期間H3K79me2重編程規(guī)律進行了研究,揭示了H3K79me2在豬早
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