脂聯(lián)素對心肌氧應激致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激損傷的保護及其機制分析.pdf

1、目的：通過原代培養(yǎng)SD大鼠的乳鼠心肌細胞建立H2O2心肌細胞氧應激損傷模型，觀察脂聯(lián)素(Adiponectin，APN)對心肌細胞氧應激所致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的保護作用及其機制。
　　 方法：采用酶消化法原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，通過α肌動蛋白免疫熒光法對培養(yǎng)的心肌細胞進行鑒定。選用原代培養(yǎng)的3-4天的心肌細胞隨機分為七組：①正常對照組；②過氧化氫(H2O2)組；③脂聯(lián)素+H2O2組；④脂聯(lián)素+阿糖胞苷(A

2、raA，AMPK途徑抑制劑)+H2O2組；⑤AraA+H2O2組；實驗終止后，在倒置相差顯微鏡下觀察心肌細胞形態(tài)的變化，采用化學比色法測定乳酸脫氫酶(LDH)的釋放，通過瓊脂糖凝膠電泳及流式細胞術(shù)來檢測心肌細胞的凋亡。用RT-PCR和Western-blot測定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激指標GRP78，Caspase-12，CHOP，JNK，AMPK的表達。
　　 結(jié)果：(1)細胞鑒定：熒光顯微鏡下可見細胞胞漿內(nèi)均呈現(xiàn)綠色熒光，即胞漿內(nèi)表達α-

3、肌動蛋白，符合心肌細胞特征。(2)各組細胞形態(tài)學比較：H2O2組細胞偽足縮短或消失，搏動減弱；APN+H2O2組細胞生長較好，形態(tài)變化明顯小于H2O2組；APN+AraA+H2O2組細胞形態(tài)生長明顯較APN+H2O2組差，但與H2O2組相比生長較好。(3)心肌細胞LDH釋放量的變化：H2O2組心肌細胞LDH釋放量較空白對照組有所增加(1344.66±138.51 vs353.33±50.32，p＜0.05)；APN+H2O2組LDH的釋

4、放量較H2O2組下降(686.67±61.1 vs1344.66±138.51，p＜0.05)；而APN+AraA+H2O2組與APN+H2O2組相比LDH的釋放量有所增加(914.33±103.12 vs686.67±61.1，p＜0.05)，與H2O2組比較下降，差異有統(tǒng)計學意義，p＜0.05；AraA+H2O2組與H2O2組比較差異無統(tǒng)計學意義，p＞0.05。(4)瓊脂糖凝膠電泳DNA結(jié)果分析：空白對照組未顯示出DNAladder

5、，而H2O2組與AraA+H2O2組均有明顯的DNA ladder形成，APN+H2O2組可以明顯地減弱DNA ladder的形成，APN+AraA+H2O2組ladder的條帶亮度介于兩者之間。(5)各組心肌細胞凋亡率的比較：正常對照組細胞集中在B3區(qū)，在B4區(qū)和B2區(qū)內(nèi)分布較少，凋亡率為1±0.625％；H2O2組出現(xiàn)大量凋亡細胞，并有部分壞死細胞，其凋亡率為69±5.29％，較空白對照組顯著升高，p＜0.05；AraA+H2O2組

6、與H2O2組無明顯差別，凋亡率為70.67±6.43％，p＞0.05；APN+H2O2組與H2O2組相比B4區(qū)和B2區(qū)的細胞分布顯著減少，凋亡率顯著降低為43.63±3.85％，與H2O2組相比差別有統(tǒng)計學意義，p＜0.05；APN+AraA+H2O2組與APN+H2O2組相比凋亡率明顯升高，為59.87±4.44％，p＜0.05，但低于H2O2組，p＜0.05。(6)GRP78mRNA，Caspase-12 mRNA的表達：RT-PC

7、R結(jié)果顯示H2O2組mRNA表達水平與對照組相比增加了3倍(P＜0.05)，給予APN預處理后再給予H2O2 GRP78，Caspase-12 mRNA表達水平則明顯減弱(P＜0.05)，APN+H2O2+AraA組GRP78，Caspase-12 mRNA表達水平介于APN+H2O2和H2O2之間。(P＜0.05)(7)各組心肌細胞中GRP78，Caspase-12，CHOP，JNK，AMPK蛋白的表達。Western blot結(jié)果顯

8、示H2O2組GRP78，Caspase-12，CHOP，JNK，AMPK蛋白表達與對照組相比均明顯增加，給予APN預處理后再給予H2O2，GRP78，CHOP，JNK，AMPK蛋白表達水平則明顯減弱(P＜0.05)，APN+H2O2+AraA組GRP78，CHOP，JNK，AMPK蛋白表達水平介于APN+H2O2和H2O2之間(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：(1)H2O2可以誘導心肌細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激；(2)脂聯(lián)素可以通過減輕內(nèi)質(zhì)