豬TTV1-ORF1和TTV2-ORF1基因的克隆、表達及生物信息學分析.pdf

1、Torque teno virus(TTV)是日本科學家 Nishizawa等在1997年運用代表性差異分析（Representational difference analysis,RDA)技術從不明原因的輸血后肝炎患者血清中發(fā)現的一種新的環(huán)狀單鏈 DNA病毒，又名輸血傳播病毒、細環(huán)病毒。國內外學者先后在世界各地進行了不同動物源的 TTV流行病學調查及病原學研究，發(fā)現 TTV1和 TTV2是仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的潛在致病病毒，ORF1

2、可能編碼該病毒的核衣殼蛋白。目前國內外通常采用 PCR方法檢測該病毒，該方法雖具有準確性高的優(yōu)點，但難以快速廣泛應用于各養(yǎng)殖場。血清 ELISA的檢測方法可以快速批量進行動物疾病的流行病調查。因此，本研究通過巢式 PCR方法擴增獲得豬 TTV1-ORF1和 TTV2-ORF1全長基因，分別克隆至克隆載體pEASY-T1,驗證正確后，利用生物信息學軟件及在線分析軟件對測序結果進行生物信息學分析,將驗證正確的豬 TTV1-ORF1-XJ和

3、TTV2-ORF1-XJ亞克隆至表達載體 pEASY-E1，使用工程菌菌株 Transetta(DE3)、菌株 BL21（DE），Trans1-T1 Phage Resistant化學感受態(tài)細胞進行原核誘導表達。本研究為構建豬 TTV重組蛋白間接 ELISA診斷方法奠定了基礎。
　　主要結果如下：
　　1、根據 Genbank上已發(fā)表的豬 TTV1和 TTV2全長基因序列分別設計兩對上下游引物，通過巢式 PCR方法擴增到19

4、17bp、1878bp的 TTV1-ORF1-XJ、TTV2-ORF1-XJ目的片段，并將這兩個 PCR產物分別插入克隆載體 pEASY-T1，測序并驗證。
　　2、利用生物信息學軟件及在線分析網站對其理化性質、功能結構域及蛋白質二級結構、3D結構等信息進行了分析。結果表明 TTV1-ORF1-XJ翻譯得638個氨基酸，具有親水性，磷酸化位點主要分布于絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸，預測發(fā)現其 N端附近有大量精氨酸，翻譯得到的蛋白存在于細

5、胞膜內外，未見信號肽序列，存在1個跨膜區(qū)以及31個 B細胞線性抗原表位。氨基酸穩(wěn)定性分析預測該蛋白中間有一段不穩(wěn)定區(qū)域。TTV2- ORF1-XJ翻譯得到625個氨基酸。其他信息與 TTV1-ORF1-XJ預測結果相似。
　　3、將測序驗證正確的豬 TTV1-ORF1-XJ和 TTV2-ORF1-XJ基因亞克隆至表達載體，轉入大腸桿菌 BL21（DE），和 Transetta(DE3)后轉入 Trans1-T1 Phage Res

6、istant化學感受態(tài)細胞，用 IPTG在37℃和28℃下，使用 IPTG濃度為0.01 mM/μL，0.02 mM/μL,0.05 mM/μL,0.1 mM/μL,0.2 mM/μL誘導表達6-8小時，經SDS-PAGE和 Western Blot印跡分析，結果顯示，構建的表達載體TTV1-ORF1-XJ-E1和 TTV2-ORF1-XJ-E1蛋白表達量極低，在不同條件下未見明顯變化，且 TTV2-ORF1-XJ-E1表達過程中具有蛋