大鼠KIAA0280在神經(jīng)元凋亡模型中的表達研究及其克隆表達和純化.pdf

1、缺血性腦血管病是當今危及人類健康和生命的主要疾病之一，然而治療該病的有效方法相當缺乏。近年來，缺血性腦血管病機制和治療的研究已深入到基因水平，而研究腦缺血中差異表達的基因及其所編碼的蛋白質在腦缺血損傷中的作用，以進一步探索腦缺血損傷的病理生理機制，已成為尋找治療缺血性腦血管病靶位基因和新途徑的熱點之一。 本實驗室前期工作中利用熒光差異顯示RT-PCR(FDDRT-PCR)技術研究了急性腦缺血大鼠中腦缺血區(qū)與非缺血區(qū)差異表達的基因

2、，得到了一條在腦缺血區(qū)明顯表達上調的基因，同源性分析發(fā)現(xiàn)該基因與人KIAA0280的同源性達95％，與小鼠的達97％，因而命名為大鼠KIAA0280；表達譜分析表明KIAA0280在腦組織中高度表達。為進一步探討大鼠KIAA0280在其他因素誘導的神經(jīng)元損傷過程中的表達是否發(fā)生變化，其是否在這個過程中發(fā)揮促進或抑制神經(jīng)元損傷的作用，我們建立了神經(jīng)元凋亡模型，初步探討大鼠KIAA0280在這些神經(jīng)元凋亡模型中的表達情況。同時，本課題進行了

3、大鼠KIAA0280的克隆表達和純化，以獲得大量高純度的蛋白質，用于其后續(xù)的抗體制備、晶體結構的預測及其相關功能的研究。 第一章大鼠KIAA0280在神經(jīng)元凋亡模型中的表達研究本章初步探討了大鼠KIAA0280在體外谷氨酸誘導的大腦皮質神經(jīng)元凋亡模型、低鉀誘導的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型和缺氧誘導的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型中的表達的情況。 方法：大鼠皮質神經(jīng)元和小腦顆粒神經(jīng)元的分離和原代培養(yǎng)；建立谷氨酸誘導的大腦皮質神經(jīng)元凋亡

4、模型、低鉀誘導的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型和缺氧誘導的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型；倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學改變；二乙酸熒光素(fluoresceindiacetate，F(xiàn)DA)染色檢測神經(jīng)元的代謝活性(metabolicactivity)和存活率(viability)；Hoechst33258染色觀察神經(jīng)元核及染色質的形態(tài)變化；用本實驗室自制的大鼠KIAA0280多克隆抗體行WesternBlot蛋白免疫印跡法檢測大鼠KIAA0280蛋

5、白表達水平。 結果：成功建立了谷氨酸誘導的大腦皮質神經(jīng)元凋亡模型、低鉀誘導的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型和缺氧誘導的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型；大鼠KIAA0280在谷氨酸誘導的大腦皮質神經(jīng)元凋亡模型中的表達呈持續(xù)下降趨勢；大鼠KIAA0280在缺氧誘導的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型中的表達呈早期上升后下降的趨勢；大鼠KIAA0280在低鉀誘導的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型中的表達呈上升趨勢。 第二章大鼠KIAA0280的克隆表達和純化本研究

6、首先選用帶有His-tag的原核表達載體PQE30，在大腸桿菌中進行了大鼠KIAA0280的克隆表達和純化，得到了His-KIAA0280融合蛋白的包涵體；隨后，為表達可溶蛋白做準備，本實驗構建和克隆了大鼠KIAA0280的酵母表達載體pPICZB-KIAA0280，并將其轉化入酵母GS115、X-33和KM71H中。 第一節(jié)大鼠KIAA0280在大腸桿菌中的克隆表達和純化方法：PCR擴增大鼠KIAA0280的ORF；TA克隆該

7、基因并酶切鑒定；構建帶有His-tag的原核表達載體PQE30-KIAA0280后行酶切、測序鑒定；將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，用IPTG誘導表達；行SDS-PAGE分析；并用本實驗室自制的KIAA0280多克隆抗體進行WesternBlot特異性鑒定；經(jīng)可溶性分析后，在變性條件下用NI-NTAHis-Bind樹脂純化蛋白質包涵體。 結果：成功構建了原核融合表達載體PQE30-KIAA0280；成功誘導表達了分子量

8、約27KDa的His-KIAA0280融合蛋白質；純化后得到融合蛋白的包涵體。 第二節(jié)大鼠KIAA0280酵母重組表達質粒的克隆和轉化方法：PCR擴增大鼠KIAA0280的ORF；TA克隆該基因并酶切鑒定；構建pPICZB-KIAA0280表達載體并行酶切、測序鑒定；將pPICZB-KIAA0280線性化后，電轉化入酵母GS115、X-33和KM71H中；然后，我們行PCR分析目標基因是否整合進GS115、X-33和KM71H基