人源抗-CTGF單鏈抗體的制備及其在抑制肺成纖維細胞向肌成纖維細胞表型轉化中作用的研究.pdf

1、背景：結締組織生長因子(CTGF)可以促進細胞外基質的產生和沉積，是導致肺纖維化的關鍵因子。阻斷CTGF可能是治療肺纖維化的有效方法。
　　目的：制備抗結締組織生長因子單鏈抗體(scFv)，研究其住抑制肺纖維化形成和發(fā)展中的作用，探索其對肺成纖維細胞表型轉化的影響以及可能的信號通路，初步闡明其作用機制。
　　方法：使用定點突變試劑盒將前期構建的質粒pET32a-TrxA-His-scFv-His突變?yōu)閜ET32a-TrxA-

2、scFv-His并將之轉化到E.coli.BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，IPTG誘導表達融合蛋白TrxA-scFv-His，經過凝血酶酶切及兩次鎳柱親和層析得到抗CTGF單鏈抗體蛋白，SDS-PAGE電泳檢測其純度，ELISA檢驗其免疫學活性。使用TGF-β1與制備的scFv共同干預人胚肺成纖維細胞，通過RT-PCR、免疫熒光實驗及Western Blot技術檢測各組人胚腫成纖維細胞中的α-SMA的表達水平。Western Blot檢

3、測scFv對HELF的D-Akt的影響。
　　結果：SDS-PAGE電泳顯示經過親和層析得到的抗CTGF單鏈抗體純度在95％以上，ELISA實驗表明抗其能夠CTGF特異性結合，RT-PCR、Western Blot及免疫熒光實驗顯示TGF-β1對人胚肺成纖維細胞的α-SMA上調表達作用能夠被抗CTGF單鏈抗體所抑制。Western Blot結果顯示抗CTGF單鏈抗體可抑制人胚肺成纖維細胞的Akt的磷酸化。
　　結論：我們制備