表沒食子兒茶素沒食子酸酯對大鼠脊髓損傷急性期的保護作用及機制.pdf

1、目的:建立第8胸椎(T8)半切型脊髓損傷(spima cord injury,SCI)大鼠模型,并采用過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)誘導氧化應激損傷的PC12細胞作為神經(jīng)損傷的細胞模型,從抗氧化、抗炎、抗凋亡等方面探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigalloeatechin-3-gallate,EGCG)對脊髓損傷急性期的保護作用及其可能機制。
　　 方法:從在體和離體兩方面來研究EGCG對脊髓損傷的

2、影響。
　　 1 在體實驗:
　　 (1)半切型脊髓損傷模型的建立及分組與給藥
　　 成年雌性SD大鼠T8處半切脊髓,造成SCI模型后隨機分為6組:假手術組(暴露脊髓,但不進行半切)、模型組(SCI組)、陽性藥組(甲基強的松龍,methyllprednisolone sodiu suecinate,MPSS,100 mg/kg)、EGCG低劑量組(25mg/kg)、EGCG中劑量組(50 mg/kg)、EGCG高

3、劑量組(100 mg/kg)。動物SCI術后5 min,假手術組和模型組給予生理鹽水(10 ml/kg,ip),其余各組ip給予生理鹽水配制的藥物。
　　 (2)SCI急性期脊髓組織病理組織學及超微結構的觀察
　　 SCI大鼠給藥24 h后以損傷處為中心取下2 cm脊髓,放入含1 ml多聚甲醛溶液的EP管中避光保存做HE染色的病理切片;以損傷處為中心取下1 cm脊髓,用面刀切成1mm3的小塊置于2.5％0.5 ml的戊二

4、醛溶液中做透射電鏡。
　　 (3)SCI急性期血清炎癥因子的檢測
　　 SCI大鼠給藥24 h后摘右眼球取血5 ml,取血清,采用ELISA法測定血清白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細胞間粘附分子-1(ICAM-1)含量。
　　 (4)SCI急性期抗氧化酶系統(tǒng)與活性氧簇的測定
　　 SCI大鼠給藥24 h后取脊髓制備成

5、1％的組織勻漿,根據(jù)試劑盒說明書檢測脊髓中SOD、MDA、O.2-、NO水平。取脊髓組織制備成凝膠電泳樣本,采用Western blot法測定脊髓中iNOS蛋白表達水平。
　　 (5)SCI急性期凋亡有關因子B-細胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相關X蛋白(Bax)的檢測
　　 SCI大鼠給藥24 h后,取脊髓組織制備成凝膠電泳樣本,采用Western blot法測定脊髓中Bcl-2和Bax蛋白表達。<

6、br>　　 (6)SCI急性期內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子營養(yǎng)因子-3(NT-3)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的測定
　　 SCI大鼠給藥24 h后,取脊髓組織制備成凝膠電泳樣本,采用Western blot法測定脊髓中內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子NT-3和BDNF蛋白表達。
　　 2 離體實驗:
　　 (1)H2O2誘導的細胞損傷模型的建立
　　 PC12細胞以2×105/cm2接種在50 ml細胞培養(yǎng)瓶,常規(guī)培養(yǎng),

7、培養(yǎng)液每天更換一次,48 h內(nèi)當細胞匯集至80％時進行傳代接種。細胞加藥處理前采用血清饑餓法使之同步化。加入H2O2(終濃度100～600 μmol/L)孵育2 h,用噻唑藍(MTT)法確立PC12細胞損傷模型。
　　 (2)EGCG對H2O2誘導氧化應激損傷的PC12細胞的保護作用
　　 細胞用EG-CG和H2O2處理后,收集細胞培養(yǎng)液,根據(jù)乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒說明檢測細胞外LDH水平,用以檢測細胞膜通透性及完整

8、性；采用MTT法觀察細胞線粒體完整性與細胞活力；收集EGCG和H2O2處理后的細胞,用流式細胞術測定細胞周期分布以及細胞增殖率；將細胞接種至內(nèi)有爬片的6孔培養(yǎng)板,孵育、同步化,用EGCG和H2O2處理后,吸棄上清液,每孔加入10 μmol/L BrdU液1 ml,孵育24 h,BrdU免疫熒光法檢測細胞周期相S期DNA增生。
　　 (3)EGCG對H2O2誘導氧化應激損傷的PC12細胞保護作用的機制
　　 收集EG-CG

9、和H2O2處理后細胞,試劑盒測定細胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的水平。同時根據(jù)試劑盒說明書依次測定活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)中超氧自由基(O.2-)、羥自由基(-OH)、誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)的活性與一氧化氮(NO)含量。采用Western blot檢測iNOS蛋白水平,采用real timeRT-PCR測定iNOS-mR

10、NA水平。
　　 結論:我們采用T8處半切大鼠脊髓造成SCI體內(nèi)損傷模型,以及采用H2O2誘導PC12細胞損傷造成神經(jīng)損傷體外模型,在體與離體給予EGCG干預,通過生化指標及病理的指標觀察EGCG對脊髓損傷的作用,主要結論如下:
　　 (1)EGCG能保護SCI大鼠受損脊髓,這種保護作用源于:減少SCI大鼠血清炎癥因子含量,有顯著抗炎作用；提高SCI大鼠脊髓中抗氧化酶系統(tǒng)活性,抑制氧自由基及iNOS-NO通路的激活而發(fā)揮