組織工程化神經的體外構建及其修復大鼠坐骨神經缺損的研究.pdf

1、第一部分:組織工程化神經的體外構建
　　目的：
　　采用背根神經節(jié)（DRG）神經元、施萬細胞與生物材料支架在體外共培養(yǎng)，構建成一種類似神經組織的組織工程化神經，從而為更好地模擬自體神經移植修復神經缺損提供新技術。
　　方法：
　　1.取新生1d SD大鼠坐骨神經，通過反復植塊法獲取高純度的施萬細胞；
　　2.施萬細胞注入絲素蛋白神經移植物管腔內，于生物反應器中培養(yǎng)7 d后，兩端各植入胚胎14.5-16.5d

2、 SD大鼠L4-6 DRGs；
　　3.培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立施萬細胞/背根神經節(jié)(DRG)共培養(yǎng)體系，體外構建組織工程化神經；
　　4.免疫細胞化學染色觀察施萬細胞、DRG與絲素蛋白神經移植物共培養(yǎng)2w的情況；
　　5.掃描電鏡分別于共培養(yǎng)2w、3w和4w后，觀察絲管內細胞生長情況；
　　6.透射電鏡觀察共培養(yǎng)3w后，絲管內超微結構和髓鞘形成情況。
　　結果：
　　1.建立了施萬細胞/背根神經節(jié)(DRG

3、)/絲素蛋白神經移植物共培養(yǎng)體系，體外成功構建組織工程化神經；
　　2.免疫細胞化學染色觀察施萬細胞、DRG與絲素蛋白神經移植物共培養(yǎng)2w后， S100陽性施萬細胞與NF陽性DRG神經突起沿著絲素纖維，呈條帶狀縱向平行生長；
　　3.掃描電鏡觀察結果表明，施萬細胞與DRG神經突起呈縱向平行生長，共培養(yǎng)4w后有類似基質樣結構形成；
　　4.透射電鏡結果顯示，施萬細胞、DRG與絲素蛋白神經移植物共培養(yǎng)3w后，有髓鞘的形成。

4、
　　結論：
　　采用施萬細胞、DRG與絲素蛋白神經移植物體外聯(lián)合培養(yǎng)，可構建成具有神經樣結構的組織工程化神經。
　　第二部分:組織工程化神經修復大鼠坐骨神經缺損的研究
　　目的
　　采用形態(tài)學、生物化學和電生理學等方法，檢測組織工程化神經修復大鼠坐骨神經缺損的功能效果，為進一步完善組織工程化神經的構建提供參考。
　　方法
　　1.將體外構建的組織工程化神經橋接修復大鼠坐骨神經10mm缺損；

5、r>　　2.術后12w，檢測再生神經干動作電位，并計算神經傳導速度；
　　3.術后4w，6w，8w，10w和12w，測量并計算坐骨神經功能指數；
　　4.術后4w、12w，采用免疫組織化學方法觀察再生神經干的生長情況；
　　5.術后12w，透射電鏡觀察再生髓鞘的厚度和髓鞘的板層數；
　　6.術后12w，測量并計算靶肌橫截肌纖維面積和單位面積膠原纖維百分數。
　　7.術后4w，Western blot檢測再生

6、神經干中細胞粘附分子N-cadherin和周圍髓鞘蛋白22（PMP22）的表達。
　　結果
　　1.組織工程化神經修復大鼠坐骨神經10mm缺損，術后12周，組織工程化神經組（nTENG）坐骨神經干復合肌動作電位（CMAP）與陽性對照的自體神經組（Autograft）相比沒有顯著差異,均明顯優(yōu)于絲素導管組(Scaffold)（P<0.05）。組織工程化神經組（nTENG）的神經傳導速度（MCV）與自體神經組（Autograft

7、）相比沒有顯著差異。
　　2.術后12 w，組織工程化神經組（nTENG）坐骨神經功能指數（SFI）與陽性對照的自體神經組（Autograft）相比無顯著差異，均明顯優(yōu)于絲素導管組(Scaffold)（P<0.05）。
　　3.術后4w，免疫組織化學結果表明，組織工程化神經組（nTENG）與陽性對照的自體神經組（Autograft）均有成束的再生神經纖維形成；術后12w,再生神經纖維數量顯著增加。
　　4.術后術后4w

8、和12 w，組織工程化神經組（nTENG）與陽性對照的自體神經組（Autograft）再生髓鞘的厚度和髓鞘的板層數與對側非手術側的比率，均顯著高于絲素導管組(Scaffold)（P<0.05）。
　　5.術后12 w，組織工程化神經組（nTENG）與陽性對照的自體神經組（Autograft）的靶肌纖維的橫截面積，顯著高于絲素導管組(Scaffold)（P<0.05）；而膠原纖維占肌纖維的百分率，均顯著低于絲素導管組(Scaffol

9、d)（P<0.05）。
　　6.術后4w，組織工程化神經組（nTENG）與自體神經組（Autograft）N-cadherin的表達水平顯著高于絲素導管組（P<0.05）；而PMP22的表達水平從2w開始顯著高于絲素導管組（P<0.01）。
　　結論
　　1.組織工程化神經修復大鼠坐骨神經10mm缺損，復合肌動作電位、運動神經傳導速度、髓鞘厚度和板層數等功能指標均優(yōu)于絲素導管組，與自體神經組無顯著差異，組織工程化神經修

10、復周圍神經缺損明顯促進損傷神經功能的恢復；
　　2.組織工程化神經修復大鼠坐骨神經10mm缺損，可以促進再生和髓鞘形成等相關因子的表達。
　　第三部分:周圍神經損傷后近端神經的基因表達和核心調控因子分析
　　目的
　　采用基因芯片技術檢測坐骨神經損傷后差異基因的表達，通過 Signal-flow方法，尋找周圍神經損傷后近端神經損傷應答相關的核心調控因子，為優(yōu)化組織工程化神經提供理論依據。
　　方法
　

11、　1.采用隨機方差模型（RVM），系統(tǒng)性分析大鼠坐骨神經橫斷后0h,0.5h,1h,3h,6h和9h近端神經表達譜芯片，分析顯著性差異表達基因；
　　2.對差異基因進行表達趨勢 STC的顯著性分析，得到顯著性的表達趨勢和趨勢的所屬基因；
　　3.對主流表達趨勢所包含的基因進行功能顯著性分析和Pathway分類，得出主流趨勢的基因最顯著、靶向的功能和參與的顯著性的Pathway；
　　4.根據差異基因參與的顯著性Path

12、way，利用數據庫中的基因間的調控關系與基因的表達情況，定量化研究不同時間序列下的基因間的信號調控網絡Signal-Flow。從而發(fā)現(xiàn)對整個基因表達變化影響最顯著的核心調控因子；
　　5.結合實驗驗證
　　(1) qRT-PCR驗證芯片結果；
　　(2) Western blot/免疫熒光檢測不同時間點重要候選因子的表達和定位；
　　(3)原代培養(yǎng)施萬細胞，采用基因干預、western blot等方法進行相關功能

13、的驗證；
　　(4)關鍵核心調控因子的信號通路研究。
　　結果
　　1.大鼠坐骨神經離斷后0h,0.5h,1h,3h,6h和9h后，采用隨機方差模型(RVM)進行差異基因(mRNA)的篩選，共有2850個顯著性差異表達基因(P<0.01)；
　　2.基于 KEGG數據庫，對差異基因利用 Fisher精確檢驗和χ2檢驗（P value<0.001），共得到9個 Pathway參與坐骨神經損傷早期反應，分別與細胞因子

14、的相互作用、細胞黏附、TLRs信號途徑、細胞凋亡等相關；
　　3. Signal-Flow分析表明，抗凋亡因子、緊密連接因子、細胞極性和細胞黏附分子等，構成整個信號傳遞調控網絡的核心成分，與炎癥因子TNF-α信號通路相關的抗凋亡分子Birc2, Birc3和Tnfrsfla等在整個網絡中顯示較大的權重；
　　4. ELISA檢測坐骨神經損傷后，TNF-α炎癥因子在0h,0.5h,1h,3h,6h,9h和12h表達升高；Bir

15、c2, Birc3和Tnfrsfla的表達也相應升高；
　　5.免疫組化結果顯示，Birc2, Birc3和Tnfrsfla與坐骨神經S100陽性細胞共定位，表明施萬細胞Birc2, Birc3和Tnfrsfla參與炎癥因子介導的抗凋亡；
　　6.濃度為40ng/ml的 TNF-α處理原代培養(yǎng)的施萬細胞12h或者濃度為10 ng/ml或20 ng/ml TNF-α作用24h，均能顯著上調凋亡因子cleaved-caspase

16、3的表達；
　　7. Birc2、Birc3或Tnfrsfla SiRNA干擾施萬細胞，48h和72h后，流式細胞和TUNEL結果表明，施萬細胞的凋亡發(fā)生明顯增加。48 h時，對照組凋亡細胞數占總細胞數的的11.18%，Birc2-siRNA凋亡細胞數為25.87%(P<0.05)，Birc3-siRNA凋亡細胞數為28.94%(P<0.05)，Tnfrsf1a-siRNA組為28.64%(P<0.01)；而在72 h時，對照組凋

17、亡細胞數占總細胞數的的16.91%，Birc2-siRNA凋亡細胞數為32.23%(P<0.01)，Birc3-siRNA凋亡細胞數為36.01%(P<0.01)，Tnfrsf1a-siRNA組則達到37.52%(P<0.01)；
　　8.干擾了Birc2, Birc3和Tnfrsfla的48h和72h后，凋亡相關因子cleaved-caspase3和caspase6的表達均明顯增加(P<0.05)；
　　9. EdU染色檢

18、測不同濃度(0,2,5,10,20,40ng/ml)的TNF-α對原代培養(yǎng)施萬細胞增殖的影響，結果表明，低濃度的TNF-α（≤2 ng/ml）能促進施萬細胞增殖(P<0.05)；而高濃度的TNF-α（≥10 ng/ml）則明顯抑制增殖(P<0.01)；TNF-α抑制劑能明顯降低TNF-α的濃度效應；
　　10. Transwell結果表明，高濃度的TNF-α（≥10 ng/ml）能明顯抑制原代培養(yǎng)施萬細胞的遷移；
　　11.

19、形態(tài)學和生化檢測發(fā)現(xiàn)，高濃度的TNF-α（≥10 ng/ml）能誘發(fā)施萬細胞的凋亡。透射電鏡顯示，用10、20或40 ng/ml TNF-α處理后的施萬細胞明顯發(fā)生核固縮、細胞質出現(xiàn)空泡、以及凋亡小體的形成等典型的凋亡形態(tài)學的改變；施萬細胞caspase-7, caspase-8和caspase-9表達與陰性對照組相比，顯著增加；AnnexinⅤ染色結果顯示，TNF-α抑制劑能降低濃度為40 ng/ml TNF-α處理后施萬細胞的凋亡，

20、且呈現(xiàn)劑量依賴的關系(P<0.01)；
　　12. Co-IP結果顯示 FADD或 RIP都可以與 TRADD結合形成蛋白復合物， FADD與TRADD的相互作用隨著TNF-α濃度的升高而增強(P<0.01)；與此相反， RIP與TRADD的相互作用隨著TNF-α濃度的升高而降低(P<0.01)；
　　13. Western blot檢測發(fā)現(xiàn)p-JNK的表達量隨著TNF-α處理濃度的升高而持續(xù)增加(P<0.01)；而p-NF

21、-κB p65的表達量隨著TNF-α濃度的升高顯著降低(P<0.01)。
　　結論
　　1.周圍神經損傷后，近端神經在短時間內對炎癥反應作出應答，上調核心調控因子Birc2, Birc3和Tnfrsfla的表達，參與調控炎癥因子TNF-α誘發(fā)的抗凋亡；施萬細胞是關鍵的靶細胞；
　　2.低濃度（≤2 ng/ml）的炎癥因子TNF-α能促進施萬細胞增殖和遷移；而高濃度（≥10 ng/ml）的TNF-α則誘發(fā)施萬細胞的凋亡；