P2X7受體在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后繼發(fā)性損傷中的作用及相關機制研究.pdf

1、研究背景：
　　蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)是一種嚴重威脅人類健康的神經(jīng)外科急危重癥，約占全部腦卒中的5％～10％，其中85％的出血原因為顱內動脈瘤破裂。盡管診斷方法、血管介入、手術夾閉、以及圍手術期處理等臨床手段較前取得了巨大的進步，大大降低了動脈瘤破裂再出血的發(fā)生率，但SAH的致死率和致殘率未獲得明顯降低，其對社會經(jīng)濟造成的負擔巨大。過去四十年來，腦血管痙攣一直被認為是導致高死亡和高

2、致殘的主要因素，可惜，針對腦血管痙攣的治療臨床上并未獲得成功。近期越來越多的證據(jù)提示:腦血管痙攣可能只是SAH的病理因素之一，甚至可能僅僅只是SAH后期的臨床表現(xiàn)。事實上，多種腦損傷機制共同參與了SAH的病理生理過程，包括早期腦損傷(Early brain injury，EBI)，皮層去極化和微循環(huán)障礙等。它們相互作用，共同導致了SAH災難性的結局。其中，國際卒中學術界已經(jīng)逐漸接受了EBI是SAH致死致殘的主要原因。
　　新概念E

3、BI指從SAH后72小時以內發(fā)生的一系列腦損傷。目前，對EBI病理生理機制已有了初步的認識，主要包括動脈瘤破裂后的機械性損傷、顱內壓升高、腦血流量降低、腦灌注壓下降、大腦皮質的廣泛去極化、細胞凋亡和壞死、自噬作用、離子穩(wěn)態(tài)的破壞、炎癥反應、血腦屏障破壞、及腦水腫等，但具體的損傷機制及信號通路需要進一步的探索研究。
　　炎癥反應和神經(jīng)元凋亡是EBI機制研究的熱點。多種炎癥通路已在SAH后EBI中激活。SAH患者血液及腦脊液中的炎癥因

4、子水平與患者的損傷程度及預后密切相關。白介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)是參與EBI的主要炎癥因子，但其在SAH腦內準確的來源及具體的生成釋放機制仍不清楚。Cryopyrin炎癥小體能夠識別來自病原相關分子模式或者宿主來源的危險信號分子的信號，招募促炎癥蛋白酶caspase-1并致其自我激活。活化的caspase-1切割IL-1β和IL-18的前體，產生成熟IL-1β和IL-18。P2X7受體(P2X7 recept

5、or, P2X7R)是cryopyrin炎癥小體的上游分子。P2X7R激活導致的K+外流是cryopyrin炎癥小體激活的主要機制之一。目前，尚無P2X7R和cryopyrin炎癥小體在SAH中臨床和實驗研究。
　　SAH發(fā)生后，腦內廣泛區(qū)域神經(jīng)元發(fā)生凋亡，并導致腦損傷。動物實驗已證實:減少神經(jīng)元凋亡可以明顯改善SAH造成的神經(jīng)功能損傷。促凋亡因子和抗凋亡因子及其上游信號通路共同參與了SAH后凋亡反應的整個過程。其中，活化的cas

6、pase-3是誘導的細胞凋亡的核心，也是凋亡反應的真正執(zhí)行者。抑制caspase-3的激活對治療SAH至關重要。前期研究發(fā)現(xiàn):P2X7R可以調控caspase-3的活性。因此，本課題推測阻斷P2X7R的激活可以緩解SAH后神經(jīng)元的凋亡，從而改善SAH后的神經(jīng)功能，并探索其中相應的病理機制。
　　SAH能夠引起全身炎癥反應綜合征，并發(fā)急性多器官功能障礙，表現(xiàn)為心臟驟停，肺、腎等臟器損傷，和胃腸反應等。神經(jīng)源性肺水腫增加SAH患者的死

7、亡率，但是，其發(fā)生具體的機制和治療手段尚不明確。目前，全身炎癥反應和肺血管壓力升高是兩種可能的主要機制。P2X7R在肺組織的多種細胞膜上廣泛表達，并于炎癥反應密切相關，因此，本課題推測P2X7R可能參與了SAH引發(fā)的神經(jīng)源性肺水腫(Neurogenicpulmonary edema，NPE)，目前國內外尚未開展相關研究。
　　近年來，研究提示P2X7R參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展過程，作用廣泛而且非常重要。本研究擬在前期工作基礎

8、上，探索P2X7R阻斷劑能否減輕SAH后EBI和非神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，其保護作用是否與抗炎，抗凋亡和緩解NPE有關。
　　1.P2X7R/Cryopyrin炎癥小體在蛛網(wǎng)膜下腔出血后炎癥發(fā)生中的作用
　　研究目的：
　　本部分實驗檢測大鼠SAH后P2X7受體，cryopyrin炎癥小體的組件(cryopyrin，apoptosis-associated speck-like protein containing a CAR

9、D(ASC)，caspase-1前體）及下游的炎癥因子的表達，包括成熟IL-1β和IL-18;了解P2X7R/cryopyrin炎癥小體信號通路在SAH炎癥反應中的作用，并進一步闡明炎癥對SAH神經(jīng)功能的影響，為探索抑制SAH炎癥的破壞作用開拓新思路和提供必要的理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　根據(jù)不同的實驗內容，該部分研究分四部分:
　　(1)建立大鼠SAH血管內穿刺模型，觀察SAH后72h內P2X7R/cryopyr

10、in炎癥小體通路隨時間的變化趨勢及其是否在小膠質細胞上表達。應用Western Blot方法檢測P2X7R，cryopyrin分子及其下游主要的炎癥因子IL-1β在SAH后2h，6h，24h，48h和72h的表達情況。應用免疫熒光技術觀察P2X7R和cryopyrin炎癥小體分別與小膠質細胞共定位的情況。
　　(2)該部分實驗分為sham，SAH+Vehicle（生理鹽水，腦室注射），SAH+scramble smallinter

11、fering RNA（siRNA），SAH+P2X7R siRNA和SAH+cryopyrin siRNA。 SAH建模前24h，左側腦室注射P2X7R siRNA和cryopyrin siRNA基因敲除相應分子。采用改良Garcia評分綜合平衡木試驗評估大鼠SAH的神經(jīng)功能，干濕重法測量腦水腫及WesternBlot檢測相應的下游分子水平，包括:P2X7R，cryopyrin，活化caspase-1，成熟的IL-1β和成熟的IL-18

12、。
　　(3)該實驗分為Naive，Naive+Lipopolysaccharide(LPS)，Naive+LPS+Benzoyl benzoylATP(BzATP),Naive+LPS+BzATP+scramble siRNA，和Na(i)ve+LPS+BzATP+cryopyrinsiRNA。側腦室注射內毒素LPS建立大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥模型。在該模型上，LPS注射前21h腦室注射scramble siRNA或cryopyr

13、in siRNA，LPS注射后3h腦室注射P2X7R的激動劑BzATP。 Western Blot檢測cryopyrin，活化caspase-1，成熟的IL-1β的表達，確定大鼠腦內P2X7R和cryopyrin炎癥小體之間的關系。
　　(4)該研究內容分為sham，SAH+vehicle，SAH+brilliant blue G（BBG，5mg/kg），SAH+BBG（30mg/kg），SAH+BBG(100mg/kg)五組，選

14、取SAH后24h和72h作為觀察的時間點，采用改良的Garcia評分和平衡試驗評估大鼠SAH的行為學，干濕重法測量腦水腫，Western Blot檢測相應的下游分子水平改變，包括P2X7R，活化的caspase-1，成熟的IL-1β/IL-18和myeloperoxidase(MPO)，免疫熒光技術檢測MPO以觀察SAH后中性粒細胞的浸潤情況。
　　研究結果：
　　(1)本組研究發(fā)現(xiàn)SAH后72h內，cryopyrin和成熟

15、的IL-1β的表達在24h時達到高峰，而P2X7R的水平并沒有明顯的改變。Cryopyrin和P2X7R分別小膠質細胞的標志物為離子鈣接頭分子(Ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba-1)共熒光定位，提示上述分子在小膠質細胞內表達。
　　(2)在SAH后24h，相比vehicle和scramble siRNA，P2X7R siRNA和cryopyrin siRNA降低下游炎癥分子

16、活化caspase-1，成熟IL-1β及IL-18的表達;緩解SAH后腦水腫和改善的大鼠的神經(jīng)功能評分。
　　(3)在LPS誘導的大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥模型中，P2X7R的激動劑BzATP明顯增加下游炎癥因子:活化caspase-1和成熟IL-1β的水平。Cryopyrin siRNA能夠消除BzATP的促炎癥作用。
　　(4)中劑量BBG(30mg/kg)緩解SAH后的腦水腫，改善神經(jīng)功能評分，這種神經(jīng)功能保護作用可能與減少

17、炎癥因子:激活的caspase-1，成熟IL-1β/IL-18的表達有關。此外，BBG阻滯中性粒細胞向腦組織的浸潤。
　　研究結論：
　　SAH后，P2X7受體/cryopyrin炎癥小體信號通路激活caspase-1/IL-1β/IL-18，導致EBI中炎癥發(fā)生，該通路是調控SAH炎癥反應發(fā)生的新機制，針對P2X7R/cryopyrin炎癥小體信號通路為此后的SAH的治療開拓新思路和提供必要理論依據(jù)。
　　2.P2X

18、7R阻斷劑抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血早期神經(jīng)元凋亡的機制研究
　　研究目的：
　　本課題試圖闡明大鼠SAH后P2X7R在神經(jīng)元凋亡中的作用，并探索該作用的具體信號機制，探索P2X7R/P38絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路在SAH后神經(jīng)元凋亡中的作用，從而進一步闡明凋亡在SAH后EBI中的影響，并為探索抑制SAH后神經(jīng)元凋亡開拓新的研究思路。
　　研究方

19、法：
　　根據(jù)不同的實驗內容，該部分研究分兩部分:
　　(1)該實驗分為sham，SAH+Vehicle，SAH+BBG和SAH+BBG+BzATP。SAH建模成功后30 min，于腹腔給予BBG或相應等體積的Vehicle（生理鹽水）。P2X7R的激動劑BzATP于SAH建模前3h腦室注射。采用改良的Garcia評分和平衡木試驗分別評估SAH大鼠的行為學;干濕重法測量腦水腫及Western Blot檢測相應的下游分子水平改

20、變，包括:P2X7R，磷酸化P38 MAPK蛋白，Bcl-2及成熟caspase-3蛋白。免疫熒光雙染共定位P2X7R和神經(jīng)元細胞核(neuronal nuclei，NeuN)用來檢測該受體在神經(jīng)元上的表達分布情況。Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated uridine5'-triphosphate-biotinnick end-labeling(TUNEL)染色觀察SAH后神經(jīng)元凋

21、亡情況。
　　(2)該實驗分為sham，SAH+Vehicle，SAH+scramble siRNA和SAH+P2X7R siRNA。SAH建模前24h，通過腦室注射P2X7R siRNA敲除相應P2X7R，采用改良的Garcia評分和平衡木試驗分別評估SAH大鼠的行為學，Western Blot檢測相應的下游分子水平改變，包括P2X7R，磷酸化P38 MAPK蛋白及成熟caspase-3蛋白。
　　研究結果：
　　(

22、1)本組研究發(fā)現(xiàn)SAH后24h，P2X7R在神經(jīng)元的細胞膜上表達。
　　(2) Western blot顯示30mg/kgBBG明顯減少SAH后24h P38 MAPK磷酸化水平的表達，降低成熟caspase-3的表達水平，相反，增加抗凋亡因子Bcl-2的表達。TUNEL染色顯示BBG明顯減少SAH造成的神經(jīng)元凋亡。
　　(3)相比vehicle和scramble siRNA，P2X7R siRNA明顯減少SAH后24h磷酸

23、化P38MAPK的表達，降低成熟caspase-3的表達水平，改善SAH后的神經(jīng)功能。
　　研究結論：
　　P2X7R參與SAH后EBI中神經(jīng)元凋亡。P2X7R抑制劑降低SAH后磷酸化P38MAPK的表達，減少成熟caspase-3的表達，最終，緩解神經(jīng)元凋亡并改善大鼠神經(jīng)功能。該研究闡明了P2X7R作為EBI中凋亡的新機制，為后續(xù)的SAH的抗凋亡治療開拓新思路和提供必要理論依據(jù)。
　　3.P2X7R阻斷劑抑制蛛網(wǎng)膜下

24、腔出血后神經(jīng)源性肺損傷的機制研究
　　研究目的：
　　本部分研究試圖闡明大鼠SAH后P2X7R在SAH后NPE中的作用，該受體阻斷劑能否通過其抗炎作用緩解NPE的癥狀，從而進一步闡明炎癥在SAH后NPE中的作用，并為探索治療SAH引起的NPE開拓新的研究思路。
　　研究方法：
　　該實驗分為sham，SAH+Vehicle，SAH+BBG。SAH建模成功后30 min，于腹腔給予BBG（30mg/kg）或相應等體

25、積的Vehicle（生理鹽水）。觀察NPE相關癥狀的發(fā)生率，測量大鼠的體重及肺濕重，Western Blot檢測肺葉中相應的炎癥分子:成熟IL-1β和MPO的改變和緊密連接蛋白:zonula occludens-1(ZO-1)和occludin。明膠酶譜檢測肺組織內matrix metaltopeptidase-9（MMP-9）的活性。P2X7R和I型肺泡上皮細胞（T1-α）進行免疫熒光雙染。Hemotoxylin-eosin(HE)染

26、色比較上述三組肺損傷的情況。
　　研究結果：
　　(1)本組研究發(fā)現(xiàn)SAH后24h，P2X7R在I型肺泡上皮細胞的細胞膜上表達。
　　(2)大鼠SAH后NPE相關癥狀的發(fā)生率與P指數(shù)相一致。
　　(3) BBG減少SAH后24h肺葉組織中成熟IL-1β和MPO的水平，抑制MMP-9的活化，增加緊密連接蛋白ZO-1和occludin的水平。HE染色顯示BBG明顯緩解SAH后肺組織損傷程度。
　　研究結論：