雞腸炎沙門氏菌感染相關(guān)microRNA的鑒定及其與靶基因互作關(guān)系的研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類長度約22nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，與靶基因3'UTR結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、神經(jīng)發(fā)育、脂肪代謝等很多生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。最近研究顯示，miRNA在細(xì)菌、病毒感染中也發(fā)揮重要作用。腸炎沙門氏菌是一種食源性病原菌，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，主要通過侵襲腸道粘膜，引起嚴(yán)重的腸道炎癥。宿主的遺傳背景在雞抵御腸炎沙門氏菌感染中起重要作用，不同品系（品種）的雞對腸炎沙門

2、氏菌的易感性/抗性有顯著差異。近幾年，Solexa高通量測序技術(shù)成為各物種microRNA分析鑒定的有力工具，目前關(guān)于細(xì)菌、病毒感染雞的方面都有應(yīng)用，microRNA在雞腸炎沙門氏菌感染中的調(diào)控機制尚不清楚。
　　本研究利用腸炎沙門氏菌感染20周齡白來航雞，感染后第7天采集盲腸樣品，對照組與處理組分別構(gòu)建3個小RNA文庫，即對照組:Cp1、Cp2、Cp3，處理組:Tp1、Tp2、Tp3，共6個文庫。利用Solexa高通量測序技術(shù)分

3、析鑒定腸炎沙門氏菌感染后差異表達(dá)的miRNA，并利用熒光定量PCR對測序結(jié)果進(jìn)行分析驗證，同時，利用熒光定量PCR分析腸炎沙門氏菌感染后白來航雞與壽光雞盲腸組織中miRNA與其靶基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:
　　(1)通過Solexa高通量測序，在Cp1、Cp2、Cp3、Tp1、Tp2、Tp3六個文庫中經(jīng)過篩選獲得clean data分別為1972566、3017995、2244711、10673073、1852677和270890

4、4，分別占到其總讀數(shù)的17.724％、33.542％、17.995％、58.832％、17.570％和30.987％。
　　(2)通過生物信息學(xué)分析，共鑒定了404個已知的雞miRNA以及194個新miRNA。處理組與對照組間共有37個顯著差異表達(dá)microRNAs，其中已知的miRNA19個，包括15個上調(diào)miRNA和4個下調(diào)miRNA;預(yù)測的新miRNA共18個，包括7個上調(diào)miRNA和11個下調(diào)miRNA。
　　(3)

5、采用miRanda軟件對差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測，共預(yù)測到2897個不同的靶基因，其中636個靶基因僅由下調(diào)的miRNA調(diào)控(G1);841個靶基因僅由上調(diào)的miRNA調(diào)控(G2);1420個靶基因同時由下調(diào)和上調(diào)的miRNA調(diào)控(G3)。通過與Biomart數(shù)據(jù)庫中免疫相關(guān)的基因比對，共得到176個免疫相關(guān)的靶基因。
　　(4)利用DAVID數(shù)據(jù)庫對靶基因進(jìn)行功能分析，其中G1相關(guān)的生物學(xué)過程注釋有118條，G2相關(guān)

6、生物學(xué)過程注釋有73條，G3相關(guān)生物學(xué)過程注釋有178條，各組中均有免疫相關(guān)的生物學(xué)過程注釋顯著富集。顯著富集的信號通路主要有細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、糖酵解/糖異生、焦點粘連、黑色素生成和蛋白酶體等。
　　(5)差異表達(dá)miRNAs的qRT-PCR驗證，所選12個miRNA在白來航雞感染后第7天對照組與處理組盲腸組織中表達(dá)均差異顯著，其中11個miRNA的表達(dá)趨勢與測序結(jié)果一致，且差異倍數(shù)相近。在白來航雞感染后第14天盲腸中僅有

7、4個miRNA顯著差異表達(dá)，且調(diào)控方向均與測序結(jié)果相反;在壽光雞感染后第7天盲腸組織中，11個miRNA顯著下調(diào)。
　　(6) miRNA與免疫相關(guān)靶基因互作關(guān)系分析，在白來航雞感染后7天盲腸組織中，gga-miR-1416與TLR21、gga-miR-1416與BCL10、gga-miR-1662與TLR1LA、gga-miR-34a-5p與NOTCH和gga-miR-34a-5p與THBS1中miRNA與靶基因的調(diào)控方向相反;

8、在壽光雞感染后7天盲腸中，gga-miR-1416與IGJ、gga-miR-1416與TLR21、gga-miR-1662與TLR1LA和gga-miR-34a-5p與CCL4中miRNA與靶基因的調(diào)控方向相反。
　　本研究鑒定出37個與腸炎沙門氏菌感染相關(guān)的重要候選miRNAs;炎癥反應(yīng)、免疫系統(tǒng)發(fā)育、淋巴細(xì)胞活性、NF-kB級聯(lián)正調(diào)控等生物學(xué)過程及焦點粘連、蛋白酶體信號通路相關(guān)miRNA在腸炎沙門氏菌感染中發(fā)揮重要的調(diào)控作用;