內蒙古地區(qū)結核分枝桿菌臨床分離株分子分型研究.pdf

1、目的：
　　對內蒙古自治區(qū)結核分枝桿菌臨床分離株進行分子分型研究，了解該地區(qū)結核分枝桿菌臨床分離株的基因型構成、主要流行株及其相關傳播流行特征，進而為該地區(qū)結核病防治提供一定的基礎科學依據。
　　方法：
　　1.于2011年1月至2012年6月收集內蒙古自治區(qū)結核病防治所從臨床診斷為結核病的病人分離獲得的500株分枝桿菌臨床分離株及其背景資料和標準菌株H37Rv（ATCC27294），均由中國疾病預防控制中心傳染病預防

2、控制所結核病實驗室保藏并提供本研究使用。
　　2.采用L-J培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，收集菌體，提取全基因組DNA用于菌種鑒定和基因分型。
　　3.用多位點PCR鑒定菌種。
　　4.分別采用21 MIRU-VNTR位點的多位點串聯(lián)重復序列分析（MLVA）和間隔寡核苷酸分型（Spoligotyping）兩種基因分型方法對已鑒定為結核分枝桿菌的臨床分離株進行基因分型研究，同時應用BioNumerics5.0軟件對分型結果進行聚類分析

3、，并將Spoligotyping分型結果與國際SpolD4.0數據庫進行比對，而其中的北京家族菌株的遺傳特征則應用核轉錄因子（nuclear transcription factors or neuronot，NTF）和大片段多態(tài)性（large sequence polymorphism，LSP）進一步分析探討。
　　5.采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件、卡方檢驗（χ2 test）分析內蒙古地區(qū)北京家族菌株與主要民族、性別、年齡、結

4、核病類型及病例類型間的關系，從而探討該地區(qū)北京家族菌株的流行傳播機制。P≤0.05差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.共收集500株分枝桿菌分別分離于500例臨床診斷為結核病患者的痰標本。經多位點PCR鑒定，482株為結核分枝桿菌（MTB），用于進一步基因分型研究；另外18株為非結核分枝桿菌（NTM）。
　　2.采用MLVA方法對482株結核分枝桿菌的21個VNTR位點進行檢測，及BioNumerics軟件進行聚類

5、，可分為349個VNTR基因型，其中279株菌表現(xiàn)為獨特基因型，203株表現(xiàn)為70簇，分別含有2或2株以上的菌株。成簇率為27.59％。
　　3.經Spoligotyping分型，482株菌呈現(xiàn)出52個基因型，其中35株菌表現(xiàn)有獨特基因型，其余447株菌成簇分別為17個基因型。其北京家族菌株為主要流行株，所占比率達到86.72%（418/482）。
　　4. NTF分析北京家族菌株顯示，69.62%（291/418）菌株表現(xiàn)

6、為在NTF區(qū)存在1～2個IS6110的插入，稱之為“現(xiàn)代型”，剩下30.38%（127/418）菌株表現(xiàn)為NTF區(qū)完整，即屬于“古典型”。
　　5. LSP中RD105的分析結果與Spoligotyping分型結果一致，在RD105表現(xiàn)缺失的418株結核分枝桿菌，在Spoligotyping分型中的35到43間隔區(qū)存在3～9個雜交，即表現(xiàn)為北京家族。然而，RD181分析表現(xiàn)為6.46%（27/418）的菌株中RD181完整，93.

7、54%（391/418）的菌株中RD181缺失。這27株（21.26%，27/127）RD181完整的北京家族菌株在NTF都表現(xiàn)為“古典型”，但其余100株（78.74%，100/127）“古典型”北京家族菌株表現(xiàn)為RD181缺失。
　　6. MLVA和Spoligotyping的比較，MLVA分辨率明顯高于Spoligotyping，而Spoligotyping對北京家族的鑒定有利于MLVA進一步對該家族進行株水平的分析。

8、>　　7.內蒙古地區(qū)北京家族菌株與主要民族、性別、年齡、結核類型及病例類型間的關系分析，差異均無統(tǒng)計學意義（均為P＞0.05）。
　　結論：
　　1.內蒙古地區(qū)結核分枝桿菌臨床分離株存在明顯的基因多態(tài)性，且北京家族為該地區(qū)的主要流行株。
　　2. RD105與Spoligotyping二者鑒定北京家族菌株的能力一致。北京家族菌株中“現(xiàn)代型”占主要，且RD181的分析顯示其缺失發(fā)生早于NTF區(qū)IS6110的插入。