油茶親環(huán)素、鈣調(diào)素基因c的DNA克隆及親環(huán)素基因的原核表達(dá).pdf

1、油茶是我國(guó)重要的木本食用油料樹種,栽培面積大,分布廣,適應(yīng)性。茶油中富含油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸,是一種優(yōu)質(zhì)食用植物油,其副產(chǎn)品也有重要用途。親環(huán)素基因是多基因家族,包括親環(huán)素A、親環(huán)素B、親環(huán)素C、親環(huán)素D等多種類型,廣泛分布于幾乎所有生命體中。它具有肽脯氨酰順反異構(gòu)酶活性,充當(dāng)伴侶分子,是蛋白質(zhì)折疊的限速酶。在蛋白質(zhì)折疊、輸送、細(xì)胞的形成、生長(zhǎng)、成熟、凋亡、mRNA加工、信號(hào)傳導(dǎo)、人類Ⅰ型免疫缺陷病毒的感染以及復(fù)制等多種生理活動(dòng)中

2、發(fā)揮重要作用。植物親環(huán)素基因還在逆境脅迫應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究以中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林育種與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的油茶cDNA文庫(kù)和EST文庫(kù)為材料,分離克隆了油茶親環(huán)素基因、鈣調(diào)素基因,構(gòu)建油茶親環(huán)素基因的原核表達(dá)載體并表達(dá)得到油茶親環(huán)素蛋白。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.首次成功地分離鑒定了油茶種子親環(huán)素基因的cDNA序列。該cDNA全長(zhǎng)975bp,包含一個(gè)621bp的編碼區(qū)及5’端非編碼區(qū)和帶Poly(A)的3’端非

3、編碼區(qū),編碼區(qū)共有207個(gè)氨基酸。該蛋白具有26個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列,14個(gè)氨基酸的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)和2個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)等結(jié)構(gòu)域；該蛋白整體結(jié)構(gòu)為多β-折疊結(jié)構(gòu),為球狀蛋白。氨基酸比對(duì)和同源性分析表明:油茶親環(huán)素基因與人類、擬南芥、茶葉的親環(huán)素基因具有高度的相似性和同源性。其中,它與茶葉親環(huán)素基因的氨基酸序列同源性高達(dá)94％,該基因含有植物親環(huán)素基因特有的7個(gè)氨基酸序列(KSGKPLH)。該基因可能參與油茶生長(zhǎng)、發(fā)育、信號(hào)傳導(dǎo)、脅迫應(yīng)答

4、以及免疫抑制等生理過程。
　　 2.首次成功地分離鑒定了兩個(gè)油茶種子的鈣調(diào)素基因cDNA序列(CaM1和CaM2)。它們的長(zhǎng)度分別為953bp和1024bp,均含有一個(gè)450bp的ORF,并編碼完全相同的149個(gè)氨基酸。油茶鈣調(diào)蛋白的這種特性符合“多個(gè)基因--一種蛋白”假設(shè)。這兩個(gè)油茶鈣調(diào)素基因的核苷酸序列在編碼區(qū)具有高度一致性,只有20個(gè)堿基替代。油茶鈣調(diào)蛋白的氨基酸序列與其他植物鈣調(diào)蛋白的氨酸序列同源性很高,一致性高達(dá)90％

5、以上。油茶鈣調(diào)蛋白由19種氨基酸組成,理論等電點(diǎn)4.10,為親水性蛋白。該蛋白不含信號(hào)肽,沒有跨膜結(jié)構(gòu),包括4個(gè)EF-手臂、鈣離子結(jié)合位點(diǎn)、半胱氨酸(Cys-27)以及一個(gè)未知功能區(qū)等結(jié)構(gòu)域。該基因可能參與油茶的細(xì)胞生K和發(fā)育、信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)控離子通道、膜蛋白、細(xì)胞分裂、受精、分泌、細(xì)胞增殖、凋亡、抗病抗逆等生理過程。
　　 3.成功地構(gòu)建了油茶親環(huán)素基因原核表達(dá)載體,并得到了油茶親環(huán)蛋白。該蛋白屬于親環(huán)素B,分子量為22.244