P38MAPK信號通路在卵巢上皮性癌順鉑耐藥中的作用機制及逆轉策略.pdf

1、目的：卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一,死亡率居婦科惡性腫瘤的首位,成為婦科惡性腫瘤威脅最大的疾病。近年來新輔助化療即先期化療(neoadjuvantchemotherapy,NACT)成為一種新的治療手段,探索先期化療在卵巢癌化療耐藥中的作用意義重大,部分卵巢上皮性癌患者對以鉑類為基礎的聯(lián)合化療方案原發(fā)耐藥或繼發(fā)性鉑類耐藥,可直接影響化療效果及患者預后。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated prote

2、in kinases,MAPK)是哺乳動物細胞內廣泛存在的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶,與細胞增殖和凋亡密切相關。研究表明,P38MAPK受抑制是順鉑耐藥的原因,但具體機制尚需探討。
　　 丹參酮ⅡA(TanⅡA)為中藥丹參的提取物,近年研究表明,丹參酮ⅡA對多種腫瘤細胞具有細胞毒性作用,并可誘導腫瘤細胞分化和凋亡,抑制腫瘤細胞侵襲和轉移,其機制可能與抑制DNA合成、調節(jié)細胞周期、影響凋亡和原癌基因的表達等有關。TanⅡA的抗腫瘤作用

3、目前在白血病、肝癌、胃癌等臨床治療中已有應用,且表現(xiàn)出較好的療效。有研究表明TanⅡA的抗腫瘤作用是通過P38MAPK信號轉導通路實現(xiàn)的。但對于TanⅡA通過P38 MAPK逆轉卵巢上皮性癌順鉑耐藥的研究尚未見報道。
　　 本實驗研究P38MAPK通路在不同化療療程上皮性卵巢癌中的表達及其與凋亡抑制蛋白Survivin、耐藥相關蛋白(切除修復交叉互補基因1(ERCC1),肺耐藥相關蛋白(LRP),谷胱甘肽轉移酶(GST-π))表

4、達的相關性及與預后的關系,并探討丹參酮ⅡA通過激活P38MAPK通路,在逆轉卵巢上皮性癌順鉑化療耐藥中的作用。
　　 方法：
　　 1、通過免疫組化實驗,檢測正常卵巢組織10例,原發(fā)性卵巢上皮癌29例,經(jīng)新輔助化療后行手術的卵巢上皮性癌患者自身配對標本17對,復發(fā)性卵巢上皮癌患者30例中p-P38,Survivin及耐藥蛋白ERCC1,LRP,GST的變化及其相關性,并進行隨訪。
　　 2、采用順鉑不同時間、不同

5、濃度作用于上皮性卵巢癌COC1及順鉑耐藥細胞COC1/DDP細胞,Western blot方法檢測P38MAPK磷酸化水平的變化。
　　 3、MTT法檢測順鉑耐藥細胞COC1/DDP細胞的順鉑耐藥指數(shù),并檢測P38MAPK抑制劑SB203580處理后COC1/DDP細胞的順鉑耐藥指數(shù)的變化。
　　 4、采用P38shRNA技術對COC1的P38基因進行干擾后檢測其耐藥指數(shù)與COC1/DDP細胞的順鉑耐藥指數(shù)進行比較。

6、r>　　 5、采用實時定量PCR技術檢測COC1、COC1/DDP細胞中、用SB203580處理細胞后及P38shRNA干擾COC1細胞后,耐藥蛋白ERCC1、MDR、LRP、GST-π及凋亡蛋白Caspase3、Survivin等mRNA的表達變化。
　　 6、采用MTT的方法繪制不同劑量TanⅡA對COC1/DDP生長曲線的影響,選取合適濃度及作用時間的TanⅡA作用于COC1/DDP后檢測其順鉑耐藥指數(shù)的變化。
　

7、　 7、采用流式細胞術檢測不同劑量TanⅡA作用不同時間后對COC1/DDP凋亡的影響,并檢測TanⅡA、Cisplatin、SB203580及其聯(lián)合用藥后對COC1/DDP凋亡的影響。
　　 8、采用Western blot方法檢測不同劑量TanⅡA作用不同時間后對COC1/DDP細胞中P38及p-P38蛋白表達水平的影響,并檢測TanⅡA、Cisplatin、SB203580及其聯(lián)合用藥后對COC1/DDP細胞中P38及P

8、-P38蛋白表達水平的影響。
　　 9、采用實時定量PCR的方法檢測TanⅡA、Cisplatin、SB203580及其聯(lián)合用藥后對COC1/DDP細胞中耐藥蛋白ERCC1、MDR、LRP、GST-π及凋亡蛋白Caspase3、Survivin等mRNA表達的影響。
　　 結果：
　　 1、p-P38在原發(fā)性卵巢癌患者中的表達與新輔助化療術后患者中的陽性表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),但明顯高于復發(fā)性卵巢癌

9、組(P＜0.01);Survivin、ERCC1、GST-π在原發(fā)性卵巢癌患者中的表達與新輔助化療術后患者中的陽性表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),但明顯低于復發(fā)性卵巢癌組(P＜0.01)。
　　 2、新輔助化療前后的自身配對標本中p-P38、Survivin、ERCCl、LRP、GST-π蛋白的表達情況均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 3、p-P38與Survivin、ERCC1、LRP之間存在負相關性(p＜

10、0.01),但與GST-π之間無相關性(P＞0.05)。
　　 4、p-P38陰性組平均生存時間短于陽性組平均生存時間,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.006)。
　　 5、在一定時間濃度梯度下,順鉑可誘導卵巢癌順鉑敏感株COC1及耐藥株COC1/DDP細胞內P38MAPK的激活,但耐藥株的激活程度弱于敏感株。
　　 6、P38MAPK抑制劑SB203580及P38shRNA干擾可增加卵巢癌細胞株的耐藥指數(shù)。

11、>　　 7、應用SB203580及P38shRNA干擾后SurvivinmRNA、ERCC1mRNA及LRPmRNA的表達明顯上調。
　　 8、TanⅡA(8μg/ml)明顯降低了COC1/DDP細胞對順鉑的耐藥指數(shù)(2.35±0.22),兩者比較差異顯著(p＜0.01)。
　　 9、TanⅡA可誘導COC1/DDP細胞凋亡,呈時間及濃度依賴性。
　　 10、TanⅡA(8μg/ml)與順鉑(20μM)聯(lián)合作用

12、于COC1/DDP細胞后,細胞凋亡率顯著高于順鉑單獨作用時(p＜0.01)。P38 MAPK抑制劑SB203580(10μM)可顯著抑制TanⅡA引起的細胞凋亡率的升高(p＜0.01)。
　　 11、隨TanⅡA作用時間的增加,p-P38蛋白的表達逐漸增強(p＜0.01)。隨TanⅡA作用濃度的增加,p-P38蛋白的表達也逐漸增強(p＜0.01)。
　　 12、TanⅡA(8μg/ml)與順鉑(20μM)聯(lián)合作用于COC

13、1/DDP細胞后,p-P38蛋白的表達明顯強于單獨用藥時(p＜0.01)。
　　 13、TanⅡA(80μg/ml)作用于COC1/DDP細胞48h后,與空白對照組相比Survivin(p＜0.05),ERCC1(p＜0.01),LRP(p＜0.01)及GST-π(p＜0.01)的mRNA表達均顯著下調,但Caspase3及MDR無明顯變化。SB203580(10μM)可顯著上調Survivin,ERCC1及LRP的mRNA的表

14、達(p＜0.01),并可顯著上調TanⅡA引起的Survivin,ERCC1及LRP的mRNA表達下調(p＜0.01)。TanⅡA(8μg/ml)還可以減弱順鉑引起的Survivin(p＜0.05)及LRP(p＜0.01)mRNA的表達上調。
　　 結論：
　　 1、多療程化療可能通過抑制P38MAPK通路而提高Survivin、ERCC1、LRP的表達導致上皮性卵巢癌鉑類耐藥的產(chǎn)生,而新輔助化療并不能導致術后耐藥機會的

15、增加。
　　 2、P38MAPK通路的激活可能改善鉑類耐藥患者的預后。
　　 3、P38MAPK受抑制可能導致卵巢上皮性癌順鉑耐藥的產(chǎn)生,其機制可能是通過上調了Survivin、ERCC1及LRP的mRNA表達實現(xiàn)的。
　　 4、TanⅡA能夠顯著增強卵巢癌順鉑耐藥細胞對順鉑的敏感性。
　　 5、TanⅡA通過激活P38MAPK下調了抗凋亡蛋白Survivin,從而誘發(fā)了卵巢癌順鉑耐藥細胞的凋亡。