臍帶間充質干細胞體外擴增研究及其分泌細胞因子的高通量篩查.pdf

1、研究背景：間充質干細胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)也稱為多潛能間充質基質細胞,為一種非造血成體干細胞,在組織中分布廣泛,具有自我更新和多向分化能力。由于具有免疫調節(jié)、多向分化潛能、易于獲取、體外增殖快、凍存后活性損失小、免疫原性低并且無倫理問題及毒副作用等特點已經在臨床上被廣泛用于多種疾病的治療性研究。成體骨髓來源的MSCs(Bonemarrow-derivedMSCs,BM-MSCs)是研究最早且較為深入的M

2、SCs,但由于抽取骨髓對供者損傷較大、易受病毒感染、細胞數(shù)量和增殖/分化能力隨年齡顯著下降等原因限制了BM-MSCs的臨床應用。大量研究已表明,多種組織均含有MSCs,如臍帶(Umbilicalcord,UC)、脂肪等。而臍帶作為胎兒娩出后的醫(yī)療廢棄物,具有易于獲取、倫理限制小、體外易于擴增及培養(yǎng)等優(yōu)勢。因此,本實驗擬對臍帶來源的MSCs(UC-derivedMSCs,UC-MSCs)與成人BM-MSCs的生物學特性進行比較,以期望獲得

3、更佳的MSCs種子細胞來源。同時,許多研究均表明,MSCs分泌的細胞因子在MSCs治療效應中發(fā)揮至關重要的作用,但目前尚無UC-MSCs細胞因子表達譜的研究報道。因此,本實驗擬采用細胞因子抗體芯片對不同代次UC-MSCs分泌的細胞因子進行高通量篩選,為UC-MSCs傳代次數(shù)的確定并為后續(xù)治療機制的研究奠定理論基礎。
　　目的：在MSCs臨床應用中,為種子細胞來源提供實驗依據(jù);我們比較了體外分離培養(yǎng)UC-和BM-MSCs在形態(tài)特征、

4、增殖能力、表面標志和誘導分化能力等方面的差異;為給體外長期培養(yǎng)UC-MSCs的穩(wěn)定性提供實驗證據(jù),我們進一步研究了體外長期培養(yǎng)UC-MSCs的生物特性及活性變化等特點;為了確定體外培養(yǎng)UC-MSCs的較佳傳代次數(shù)并為治療機制提供一定的理論依據(jù),我們對不同代次的UC-MSCs體外分泌的細胞因子進行細胞因子抗體芯片篩查和表達譜的差異比較。
　　方法：我們分別應用酶消化法和密度梯度離心法分離UC-MSCs和BM-MSCs,并用貼壁培養(yǎng)方

5、法進一步純化兩種來源MSCs。采用顯微鏡技術觀察比較了兩者的形態(tài)特點;應用細胞計數(shù)法檢測了兩者的增殖能力;通過體外連續(xù)傳代試驗研究兩者的傳代能力;采用流式細胞術分析了兩者免疫表型;通過染色法鑒定比較體外誘導UC-和BM-MSCs向脂肪、軟骨和成骨細胞分化能力。我們進一步對UC-MSCs進行體外連續(xù)培養(yǎng),檢測了細胞生物特性和功能,并采用細胞因子抗體芯片對不同
　　代次UC-MSCs的上清液進行了高通量篩查(目標蛋白為174種細胞因子

6、,RayBio?),根據(jù)熒光強度信號情況,篩選出MSCs上清液中陽性表達的細胞因子,并采用統(tǒng)計學方法分析不同代次UC-MSCs間的分泌陽性細胞因子的信號差異。
　　結果：細胞形態(tài)結果顯示,UC-和BM-MSCs細胞形態(tài)相似,均表現(xiàn)為長梭型、貼壁生長;體外長期傳代試驗表明,BM-MSCs體外增殖能力較差,傳代至9～10代基本失去增殖能力,而UC-MSCs增殖及更新能力明顯強于BM-MSCs,傳至15代時仍保持原有的特性;細胞表型結果

7、表明,UC-和BM-MSCs具有均一的免疫表型:不表達造血和內皮標志CD34、CD45、CD11b、CD31以及免疫共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ類分子(HLA-DR),表達間質細胞標記CD44、CD105和CD166和CD73。但BM-MSCs的CD80顯著高于UC-MSCs的(P=0.0137);誘導分化結果顯示,UC-和BM-MSCs均可向脂肪、成骨和軟骨三系分化;細胞因子抗體芯片檢測結果表明,UC-MSCs上清液中陽性分

8、泌的細胞因子有102種(強陽性34種,一般陽性68種),主要涉及促細胞遷移類(24.5％)、受體類(20.6%)、促細胞生長和分化類(20.6%)和免疫調節(jié)類(12.7%);統(tǒng)計分析結果表明,第3、5和9代UC-MSCs分泌的細胞因子有顯著統(tǒng)計學差異的只有11種:TNF-beta(P=0.0147)、IL-12p70(P=0.0265)、MSP-alpha(P=0.0289)、HCC-4/CCL16(P=0.027)、IP-10/CXC

9、L10(P=0.0202)、GITR(P=0.024)、PDGFRalpha(P=0.0277)、VEGFR2(P=0.038)、IL-9(P=0.0291)、MIP-1beta/CCL4(P=0.0497)和CNTF(P=0.0073)。
　　結論：UC-MSCs能替代BM-MSCs作為臨床上MSCs的種子細胞;不同代次UC-MSCs分泌的絕大多數(shù)細胞因子水平無差異;蛋白芯片能以極小的樣本量檢測高通量的細胞因子,是篩查MSCs細