Fe3O4磁性納米顆粒的細胞效應及發(fā)生機理研究.pdf

1、隨著納米生物技術的發(fā)展，氧化鐵磁性納米顆粒(MNP)在生物醫(yī)學領域內具有了廣泛的應用，如，核磁共振成像造影劑、腫瘤磁熱療、靶向藥物載體、生物分子的標記、分離與純化等。為了評價MNP在生物體系應用中的安全性并進一步發(fā)展其在生物醫(yī)學中的應用，目前已有大量的研究表征了不同理化性質的MNP具有的生物效應。然而，大部分研究使用一種細胞系進行觀察研究，缺少來自不同物種或不同組織的細胞間系統(tǒng)的比較，也未就細胞生理表型變化在分子水平上的發(fā)生機理進行深入

2、研究。因此，使用多種細胞系和不同濃度及處理時間系統(tǒng)研究MNP作用細胞后引發(fā)的細胞效應及其發(fā)生機理仍是納米生物技術研究領域的重要課題。
　　本研究采用多濃度(20～100μg/mL)、多時間點(2～72h)和多種細胞系，包括小鼠巨噬細胞（RAW264.7）、小鼠肝癌細胞(Hepa1-6)、人單核細胞(THP-1)、人肝癌細胞（HepG2）、人正常肝臟細胞(HL-7702)及人宮頸癌細胞(HeLa)，檢測了熱解油酸-鐵制備的二巰基丁二

3、酸(DMSA)包被的Fe3O4 MNP的細胞效應，并運用基因芯片技術檢測這種MNP對細胞基因表達譜的影響，從分子水平上分析細胞效應的分子機制。本論文取得的主要結果如下:
　　1.通過普魯士藍染色、溶酶體染色、透射電鏡(TEM)觀察及比色法鐵含量測定，研究了合成的DMSA-Fe3O4 MNP標記細胞的效率。TEM及溶酶體染色觀察顯示DMSA-Fe3O4 MNP經內吞進入細胞，主要分布于細胞溶酶體內。普魯士藍染色和鐵含量定量分析表明，

4、所研究的6種哺乳動物細胞均能攝取這種DMSA-Fe3O4 MNP，但攝取效率在細胞系間存在差異。RAW264.7細胞攝取效率最高，而HepG2和HL-7702細胞吞噬能力較弱。此外，細胞對DMSA-Fe3O4 MNP的攝取具有時間和濃度雙重依賴性。低濃度長時間作用導致細胞內的鐵含量高于高濃度短時間作用，提示在研究DMSA-Fe3O4 MNP的細胞效應時要考慮其長時期作用效果。
　　2.氧化鐵納米顆粒進入細胞后，不可避免地與細胞內組

5、分發(fā)生相互作用，從而對細胞的某些功能造成損傷。為了評價DMSA-Fe3O4 MNP的生物相容性，本研究系統(tǒng)地檢測了其對6種哺乳動物細胞系多種生理功能的影響。顯微觀察顯示DMSA-Fe3O4 MNP處理細胞后，細胞形貌、細胞骨架及膜系統(tǒng)并未受到嚴重破壞。在所研究的濃度范圍(20～100μg/mL)和作用時間段(2～72h)，細胞活力隨DMSA-Fe3O4 MNP的濃度升高而呈現輕微地下降，但僅有RAW264.7和HepG2細胞在高濃度長時

6、間處理下具有顯著性差異。氧化應激測定表明，細胞內總超氧化物歧化酶和黃嘌呤氧化酶水平并沒有顯著的變化，但丙二醛水平在多個濃度下顯著增高。各濃度的DMSA-Fe3O4 MNP對細胞周期未產生顯著影響。高濃度(100μg/mL)的DMSA-Fe3O4 MNP顯著地誘導THP-1和HepG2細胞發(fā)生凋亡。結果顯示，DMSA-Fe3O4 MNP具有較好的生物相容性，尤其在體內常用劑量（30μg/mL）下對細胞多種生理功能并不產生顯著影響。

7、　　3.由于細胞的所有生理表型都基于特定基因的時空特異表達。因此，納米顆粒作用于細胞后引發(fā)細胞效應（如活力下降、氧化應激水平升高及誘導凋亡等），也必然受相應基因調控。為了從基因水平上研究DMSA-Fe3O4 MNP對細胞的潛在影響，本研究使用Affymetrix公司的Mouse Genome 4302.0基因組表達譜芯片檢測了100μg/mL DMSA-Fe3O4 MNP對RAW264.7細胞基因表達譜的影響。在DMSA-Fe3O4MN

8、P處理4、24和48h后，分別檢測到711、545和434個差異表達基因(differentially expressed gene，DEG)。這些DEG中，有27個基因在三個時間點持續(xù)上調，另有6個基因持續(xù)下調。所有DEG的生物信息學分析表明多個與炎癥、免疫反應及病毒刺激相關的基因顯著上調;參與氧化應激及脂質過氧化保護性應答基因發(fā)生下調;同時，與細胞周期、繁殖、生物大分子合成及能量代謝相關基因顯著下調。結果提示，DMSA-Fe3O4M

9、NP可誘導細胞發(fā)生氧化應激、炎癥和免疫反應，并抑制細胞的生物合成和代謝過程，這與細胞水平的實驗結果一致。
　　4.為了進一步分析DMSA-Fe3O4 MNP對不同細胞系基因表達譜的影響，本研究比較了小鼠巨噬細胞和肝癌細胞在DMSA-Fe3O4 MNP處理前后的基因表達譜的變化?；蛐酒瑱z測出數千個基因表達發(fā)生變化，絕大多數DEG在DMSA-Fe3O4 MNP濃度和細胞系間有不同的表達模式。只有15個DEG在四種處理下表達持續(xù)改變，

10、如，Id3、Slc25a23、Tfrc、Klf4、Fxyd2、Lcn2、Illrn、Slpi及Serpinb9b等基因。這些基因反映了不同哺乳動物細胞對DMSA-Fe3O4MNP處理作出的共同應答?；虮倔w論(Gene Ontology,GO)聚類分析表明，在RAW264.7細胞中，DEG主要參與內吞作用、免疫反應和鐵離子的跨膜轉運。而在Hepa1-6細胞中DEG涉及細胞發(fā)育、催化活性和信號轉導的調節(jié)。隨著細胞內鐵含量的升高，DMSA-

11、Fe3O4 MNP對Hepa1-6細胞造成與RAW264.7細胞相似的炎癥、免疫應答和趨化反應等效應。執(zhí)行這些功能的DEG在兩種細胞間不盡相同。兩種細胞間的DEG的差別表明DMSA-Fe3O4 MNP對不同細胞系具有不同的基因效應，取決于細胞系所具有的生物學功能。
　　5.基因芯片檢測結果發(fā)現，鐵離子轉運GO條目得到顯著富集，提示細胞內吞的DMSA-Fe3O4 MNP，可能通過釋放鐵離子影響細胞內鐵穩(wěn)態(tài)。熒光定量PCR結果證實3個

12、與鐵穩(wěn)態(tài)相關的關鍵性基因，Tfrc、Trf和Lcn2表達發(fā)生變化，并在鐵離子螯合劑去鐵胺作用下Tfrc和Lcn2基因表達變化受到抑制。本研究設計了一種基于高速離心方法測定細胞內鐵離子含量和氧化鐵納米顆粒含量的方法。結果表明細胞內總的鐵含量、氧化鐵納米顆粒含量及鐵離子含量均顯著增加。在體外模擬溶酶體酸性環(huán)境中，DMSA-Fe3O4 MNP發(fā)生降解，并導致溶液中鐵離子含量升高。這些結果證實細胞內鐵離子含量的升高是由聚集在溶酶體內的DMSA-

13、Fe3O4 MNP發(fā)生降解而造成的。細胞鐵離子過載導致多個負責可溶性物質載體家族成員的表達下調，如Slc5a3和Slc44a1，以阻止更多的有機溶質進入細胞，從而降低細胞內被鐵離子升高的滲透壓。這些結果解釋了DMSA-Fe3O4 MNP引發(fā)細胞內鐵穩(wěn)態(tài)及滲透壓穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化的分子機制。
　　6.為了進一步探討DMSA-Fe3O4 MNP在活體內的動態(tài)分布及主要臟器分布，為下一步的體內基因表達譜的研究提供組織和細胞選取的依據，本研究利

14、用近紅外熒光素(IRDye800CW，ex/em=775/788nm)及活體成像技術研究了這種納米顆粒在機體內的動態(tài)代謝過程及主要臟器分布。IRDye800CW標記的Fe3O4MNP對RAW264.7細胞具有很好的標記效率并對細胞活力沒有顯著影響，這樣與未標記的Fe3O4 MNP相當。將這種帶近紅外熒光素標記的Fe3O4 MNP以2和5mg/kg體重的劑量經尾靜脈注射到小鼠體內，使用近紅外熒光成像儀對小鼠進行24h不連續(xù)成像。結果發(fā)現標