RNA干擾靶向熱休克蛋白70治療胃癌的實驗研究.pdf

1、熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是生物在不利條件下產生的一種保護機體的蛋白，具有重要的病理、生理功能。在正常時以較低水平表達；在環(huán)境溫度變化、炎癥、發(fā)熱、微生物感染、腫瘤、放射等情況下均誘導其合成，從而減輕不利條件下導致的損害。近年研究發(fā)現，HSP70在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中充當了多重角色，一方面作為“分子伴侶”參與腫瘤細胞的功能代謝，保護腫瘤細胞免受有害因素的損害；另一方面作為腫瘤細胞與機體正常細胞生長、代謝、

2、分化的異質性，使HSP70成為與其相結合的腫瘤抗原多肽的靶載體，在參與腫瘤抗原的免疫反應中充當了免疫佐劑的作用。 RNA干擾(RNAi)是一種轉錄后基因沉默(Post-transcriptionalgene silence，PTGS)的基因阻斷技術，近年來被廣泛應用于哺乳動物細胞抑制基因表達。通過RNaseⅢ內切酶Dicer的作用產生有活性的小的21-23nt干擾性RNA(short interence RNA，siRNA)，介

3、導其互補同源mRNA序列的特異性降解，沉寂目的基因的表達。 本課題采用RNAi技術，設計并合成針對HSP70基因的siRNA，轉染胃腺癌細胞株SGC-7901，并進行裸鼠皮下移植瘤實驗，檢測HSP70mRNA水平和蛋白水平表達的變化；觀察siRNA對胃癌細胞生長的影響；為胃癌的基因治療探索新的方法。 第一部分 目的：構建綠色熒光蛋白(GFP)的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)，觀察其在胃癌細胞中抑制外源GFP的表達作

4、用，為下一步設計Hsp70基因的siRNA提供技術支持。 方法：設計、合成含GFP編碼基因片段的siRNA，與轉錄載體pTZU6+1連接，構建pshRNA-GFP重組質粒；重組質粒pshRNA-GFP與pEGFP-C1共轉染胃癌細胞株BGC-823和SGC-7901，檢測pshRNA-GFP對GFP表達的影響。 結果：成功構建針對GFP的siRNA重組載體pshRNA-GFP，并經序列分析驗證；應用熒光顯微鏡證實重組載體

5、pshRNA-GFP對共轉染的pEGFP-C1中綠色熒光蛋白的表達有明顯的抑制作用，明顯高于對照組，抑制率大于70％；Westeril blot檢測結果表明應用pshRNA-GFP作用后GFP蛋白表達明顯減少。 結論：構建的pshRNA-GFP重組質粒能有效地抑制GFP基因在胃癌細胞中的表達。 第二部分 目的：構建Hsp70的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)，檢測其在胃癌細胞株SGC-7901中對Hsp70基因表達的

6、抑制作用。 方法：根據Hsp70編碼基因，設計并合成3對反向重復序列，分別定向克隆至載體pTZU6+1的U6轉錄啟動子下，構建pshRNA-Hsp70質粒及對應的點突變質粒pshRNA-Hsp70’，分別轉染胃癌細胞株SGC-7901，采用RT-PCR和Western blot檢測pshRNA-Hsp70和pshRNA-HspT0’對Hsp70基因表達的抑制作用。 結果：酶切電泳分析和DNA測序證實重組質粒pshRNA-

7、Hsp70和pshRNA-Hsp70’構建成功；pshRNA-Hsp70對內源Hsp70基因的表達有明顯的抑制作用，明顯高于對照組；pshRNA-Hsp70’對目的基因基本無抑制作用。 結論：構建的重組質粒pshRNA-Hsp70能特異而有效抑制內源性Hsp70基因在SGC-7901細胞中的表達，為下一步研究siRNA對胃癌細胞生長的影響打下基礎。 第三部分 目的：利用RNAi技術在胃癌SGC-7901細胞裸鼠皮

8、下移植瘤內抑制Hsp70表達，探討pshRNA-Hsp70在體內對腫瘤生長的作用。 方法：將胃癌細胞株SGC-7901 注射入裸鼠皮下，建立裸鼠皮下移植瘤模型。pshRNA-Hsp70導入胃癌組織中，在體內誘導RNAi，采用RT-PCR和Western blot檢測Hsp70基因表達的變化．并觀察腫瘤體積的變化。 結果：pshRNA-Hsp70導入裸鼠皮下移植瘤后15d，與對照相比，Hsp70的mRNA和Hsp70蛋白顯