熱休克蛋白27在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其對化療敏感性影響的實驗研究.pdf

1、第一部分：熱休克蛋白27(HSP27)在單純乳腺增生、不典型增生及乳腺癌中的表達及其意義 目的:采用半定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術檢測并比較HSP27mRNA在單純乳腺增生、不典型乳腺增生兩種具有不同惡變風險的乳腺病變及乳腺癌中的表達，探討HSP27在乳腺組織惡性轉化過程中的作用，并分析其表達水平與乳腺癌各病理指標間的關系。 方法:收集2004.12-2005.06期間在齊魯醫(yī)院診治的68例乳腺癌患者的癌

2、組織及癌旁正常組織標本，并記錄術后病理診斷中腫瘤大小、淋巴結轉移數(shù)目和ER、PR、Her2的表達情況；同時收集同期內15例乳腺不典型增生組織、27例單純乳腺增生組織。應用RT-PCR技術檢測上述標本中HSP27 mRNA的表達，在凝膠成像系統(tǒng)下分析電泳條帶，HSP27表達的相對值=HSP27條帶光密度值/β-actin條帶光密度值，半定量分析HSP27 mRNA在單純乳腺增生、不典型增生、乳腺癌及配對的癌旁組織中的表達情況。 結

3、論:不典型增生和乳腺癌中HSP27的表達明顯增強，乳腺癌中HSP27的表達與ER顯著相關，提示HSP27的過度表達在乳腺癌形成的早期就存在，并可能在部分乳腺癌，尤其是ER陽性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起促進作用，HSP27可為探討乳腺癌發(fā)生機制、高危病例篩選提供一種新的途徑，可能成為乳腺癌預防和治療中新的靶點。 第二部分：熱休克蛋白27真核表達載體的構建與鑒定 目的:構建重組人HSP27真核表達載體，并檢測其在MDA-MB

4、-231細胞中的表達，為研究HSP27在乳腺組織惡性轉化過程中的作用及其對乳腺癌生物學行為的影響做準備。 方法:從高表達HSP27的人乳腺癌細胞MCF-7中提取總RNA，RT-PCR法反轉錄合成cDNA。設計擴增產物含有HSP27基因CDS序列的一對引物(上游引物:5'-AAGCTTCTGAGCAGACGTCCAGAGCA-3'，下劃線部分為HindⅢ酶切位點；下游引物：5'-GGATCCGCATCCGGGCTAAGGCTTT-

5、3'，下劃線部分為BamH Ⅰ酶切位點)，調取目的基因片段，與T載體連接后轉化大腸桿菌DH-5α，篩選菌落并抽提質粒。測序正確后，雙酶切克隆進入真核表達載體pCDNA3.1/myc-His(+)A中，得到重組質粒．pCDNA3.1-HSP27。用此重組真核表達載體轉染低表達HSP27的人乳腺癌細胞MDA-MB-231，采用RT-PCR和Western blot技術分別從mRNA和蛋白水平鑒定重組質粒在細胞中的表達。 結論:含人H

6、SP27全長CDS序列的pCDNA3.1-HSP27真核表達載體構建成功，并在MDA-MA-231細胞中獲得高效表達，為進一步研究HSP27在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用奠定了基礎。 第三部分：熱休克蛋白27對乳腺上皮細胞HBL-100和乳腺癌細胞MDA-MB-231生物學特性的影響 目的:用攜帶有HSP27基因的真核表達載體pCDNA3.1-HSP27分別轉染低水平表達內源性HSP27的人正常乳腺上皮細胞系HBL-100和

7、人乳腺癌細胞系MDA-MB-231，觀察和分析上調HSP27表達對兩種細胞的形態(tài)、增殖活性、DNA倍體的影響，比較MDA-MB-231細胞的粘附、侵襲和遷移能力在轉染前后的變化，探討HSP27對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的促進作用及其機制。 方法:采用陽離子脂質體法將攜帶有人HSP27基因CDS序列的真核表達載體pCDNA3.1-HSP27分別轉染入人乳腺上皮細胞系HBL-100和人乳腺癌細胞系MDA-MB-231內，以空載體質粒pCDN

8、A3.1/myc-His(+)A轉染的細胞和未接受轉染的細胞為對照，G418篩選陽性克??；采用RT-PCR和Western-blot技術檢測轉染組、空載體組和未轉染組細胞中HSP27 mRNA和蛋白的表達。分別應用倒置相差顯微鏡、MTT法和流式細胞技術，觀察和檢測轉染前后細胞大體形態(tài)的變化、細胞增殖活性的改變、細胞周期及DNA倍體的變化；RT-PCR法檢測cyclinD1、D21<'CIPl/WAFl>和p27<'KIPl>的表達。同時

9、采用MTT法檢測轉染、空載體和未轉染三組MDA-MB-231細胞與細胞外基質的粘附能力，Trariswell小室法檢測其侵襲和轉移能力，流式細胞術分析CD44v6，MMP-9和TIMP-1的表達。 結論:穩(wěn)定轉染pCDNA3.1-HSP27質粒的HBL-100和MDA-MB-231細胞內HSP27的mRNA和蛋白表達水平均明顯升高。HSP27能降低HBL-100中p27<'KIPl>的表達，從而促進細胞增殖并提高其S期細胞比例，

10、同時能夠提高細胞DNA含量，這可能是HSP27促進正常乳腺上皮細胞惡性轉化的機制；HSP27能夠降低MDA-MB-231細胞的遷移能力，但它同時能夠提高細胞DNA含量，并通過促進細胞中CD44v6和MMP9的表達，降低TIMPl的水平，提高細胞的異質型粘附和侵襲能力，這可能是HSP27促進乳腺癌發(fā)展的分子機制。 第四部分：熱休克蛋白27對乳腺癌細胞化療敏感性影響的實驗研究 目的:高表達HSP27的乳腺癌細胞能對包括阿霉素

11、在內的一些化療藥物產生耐藥，目前尚無HSP27是否影響紫杉醇抗癌作用的研究，并且據(jù)報道紫杉醇能夠抑制子宮內膜癌和卵巢癌細胞中HSP27的表達。本實驗旨在研究HSP27高表達能否誘導乳腺癌細胞對紫杉醇產生耐藥，紫杉醇能否抑制乳腺癌細胞中HSP27的表達，確定更有效的紫杉醇聯(lián)合阿霉素的使用方法。 方法:以內源性高表達HSP27的人乳腺癌細胞系MDA-MB-435、MCF-7和內源性低表達HSP27的人乳腺癌細胞系MDA-MB-231

12、為研究對象。采用MTT技術檢測分析阿霉素、紫杉醇、阿霉素一紫杉醇序貫和紫杉醇一阿霉素序貫治療對具有不同HSP27表達水平的乳腺癌細胞的腫瘤抑制作用，流式細胞術分析藥物處理后腫瘤細胞的凋亡情況；并應用Western-blot方法分析化療藥物處理前后細胞中HSP27、TopoⅡα、Topo Ⅱβ表達的變化情況。 結論:HSP27不能誘導乳腺癌細胞對紫杉醇產生耐藥；紫杉醇能夠抑制乳腺癌細胞中HSP27的表達，并提高Topo Ⅱ的表達；