鵝Ⅲ型干擾素及其受體的鑒定、組織表達與免疫學特性研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、干擾素(IFNs)是病原微生物入侵,誘導機體產生的一類具有抗病毒活性的細胞因子,屬機體Ⅱ類細胞因子,在先天免疫應答中起著非常重要的作用。目前,根據氨基酸序列、結構特點以及受體特性等,將干擾素分為Ⅲ類:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干擾素。Ⅲ型干擾素(IFN-λs)為2003年發(fā)現的一類新型干擾素,其抗病毒作用并不是直接殺傷病毒,而是通過與其特異受體IFNLR1和IL-10R2構成的異源二聚體復合物結合,激活與Ⅰ型干擾素相似的JAK-STAT信號通路,

2、誘導一系列具有抗病毒作用的干擾素刺激基因(ISGs)。
  本研究首次克隆獲得鵝Ⅲ型干擾素(goIFNL)及其特異受體(goIFNLR1)的cDNA序列,并進行了相關生物信息學分析。goIFNL的cDNA序列獲得823 bp,包含一個完整的開放閱讀框,編碼189 aa; goIFNLR1序列獲得1952bp,包含一個完整的開放閱讀框,編碼512 aa。通過NJ法進化樹分析,顯示這兩個基因屬于鳥類這一分支,與禽類親緣關系更為接近。<

3、br>  應用實時熒光定量PCR方法對goIFNL和goIFNLR1的組織分布情況進行探索,結果顯示goIFNL主要分布在呼吸道組織肺臟(LU)、氣管(TR);胃腸道組織小腸(SI)、肌胃(GI);皮膚(SK);胰腺(P)及全血(Blood)等上皮細胞豐盛的組織中,其特異受體goIFNLR1具有相似的組織分布情況。
  為了解goIFNL的免疫學特性,選用四種TLR的激動劑及三種禽類相關病毒分別刺激鵝外周血單核細胞建立體外感染細胞

4、模型,結果顯示在TLR3的激動劑Poly(I∶C)以及TLR9的激動劑ODN2006的刺激下,goIFNL mRNA的轉錄水平得到顯著性的提升。在TLR4的激動劑LPS及TLR7的激動劑R848的刺激下,goIFNL mRNA的轉錄水平相較對照組無顯著性差異。goIFNLR1 mRNA的轉錄水平在這四種TLR的激動劑的刺激下相較對照組均無顯著性差異。緊接著,我們又探究了鵝重要傳染病的病毒病原對目標分子的影響:在小鵝瘟(GPV)病毒的感染

5、下,goIFNL mRNA的轉錄水平具有顯著性的升高;在低致病性禽流感病毒(H9N2 AIV)及鴨坦布蘇病毒(DTMUV)的感染下,goIFNLmRNA的轉錄水平相較對照組無顯著性差異,而goIFNLR1 mRNA的轉錄水平在這三種病毒的刺激下均無顯著性差異。同時,選用這三種禽類病毒人工感染雛鵝建立體內動物模型,經qRT-PCR檢測goIFNL及goIFNLRI mRNA的轉錄水平,結果顯示在H9N2 AIV的感染下,goIFNL的表達

6、量相較對照組在肺臟組織(LU)中有近20倍的提升,存胰腺組織(P)中有近40倍的提升。而在其他兩種病毒的感染下,goIFNL及goIFNLR1 mRNA的轉錄水平相較對照組無顯著性差異。以上結果表明goIFNL在鵝的抗病毒固有免疫中扮演著一定的角色。
  為進一步了解其生物學功能,選擇對goIFNL進行原核和真核表達,分別構建pET-32α-goIFNL原核表達載體及pcDNA3.1-goIFNL真核表達載體。構建的原核表達質粒以

7、IPTG終濃度0.8mM誘導3h的條件在大腸桿菌BL21(DE3)中被成功誘導表達,表達的融合蛋白以包涵體形式存在。利用Ni-NTA親和層析純化重組goIFNL融合蛋白,并以此為免疫原制備鼠抗goIFNL多克隆抗體。經Western-Blot驗證,真核表達重組質粒pcDNA3.1-goIFNL能在BHK21細胞中表達goIFNL蛋白,這為goIFNL抗病毒免疫學功能的研究奠定了基礎。
  綜上,本研究成功克隆了goIFNL及goI

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