MicroRNA-21在骨肉瘤生物學行為作用機制中的研究.pdf

1、第一部分
　　 背景與目的：骨肉瘤是一種好發(fā)于青少年的惡性骨腫瘤，易發(fā)生肺轉移，是骨肉瘤患者治療失敗的一個最主要的原因。探討miR-21在骨肉瘤和正常骨組織中的表達并分析其與臨床病理之間的聯系。
　　 方法：通過實時定量PCR方法檢測42例骨肉瘤組織(包括8例來自同一患者的原發(fā)骨肉瘤組織和轉移腫瘤組織)和來自同一患者的鄰近正常骨組織中miR-21的表達并根據臨床資料評估m(xù)iR-21的臨床相關性；利用Western blo

2、t和實時定量PCR方法檢測了8例原發(fā)腫瘤組織和周圍正常骨組織中RECK的表達，并分析其與miR-21表達的聯系。
　　 結果：miR-21在所有的組織中都有表達，且在腫瘤組織中比在正常骨組織中有明顯的高表達(P=0.013)，此外，miR-21在轉移的腫瘤組織中比在同一樣本中的原發(fā)腫瘤組織中高表達(P=0.002)。然而miR-21表達與性別，年齡，病變部位，腫瘤大小，分型和分期無關。研究還發(fā)現RECK在組織中均有表達，但是RE

3、CK 蛋白的表達在正常骨組織中比在對應的腫瘤組織中高表達，而RECK mRNA表達在兩者中無明顯差異，統(tǒng)計分析發(fā)現RECK 蛋白的表達和miR-21表達之間存在顯著的負相關。
　　 結論：在本研究中第一次發(fā)現相對于周圍相鄰的正常骨組織來說，miR-21在骨肉瘤組織中呈明顯過表達，說明miR-21 高表達可以作為骨肉瘤一個診斷指標；且miR-21在轉移腫瘤組織中比在原發(fā)腫瘤組織中高表達，預示miR-21 高表達潛在的導致腫瘤轉移，

4、其可以作為骨肉瘤患者預后的一個指標；RECK蛋白與miR-21表達的負相關也許意味著RECK是miR-21的一個調控靶點，miR-21 可通過調節(jié)RECK的表達而影響腫瘤轉移。
　　 第二部分
　　 背景與目的：微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內源性的非編碼小分子RNA，其主要通過與靶mRNA 作用抑制轉錄后的翻譯。miR-21是唯一一個在9 種人類腫瘤細胞中高表達的小RNA分子。本研究旨在觀察anti-

5、miR-21 反義寡核苷酸(ASO)或是過表達質粒對miR-21表達干擾后對骨肉瘤MG-63細胞增殖，凋亡，侵襲和轉移的影響。
　　 方法：構建miR-21 ASO和miR-21 過表達真核表達質粒并通過轉染骨肉瘤細胞株MG-63，利用實時熒光定量RT-PCR檢測MG-63細胞中miR-21的表達變化，利用Western blot和實時定量PCR方法檢測了細胞中RECK的表達；并運用多種細胞增殖檢測方法觀察MG-63細胞增殖能力

6、；流式細胞術檢測MG-63細胞的凋亡率變化；Transwell細胞侵襲實驗觀察對MG-63細胞侵襲能力的影響；劃橫實驗檢測MG-63細胞遷移能力，并在體檢測miR-21 ASO 對骨肉瘤細胞增殖能力的影響。
　　 結果：經證實成功構建表達質粒；實時熒光定量RT-PCR證實miR-21 ASO轉染組miR-21表達明顯減低，而miR-21 過表達真核表達質粒組miR-21表達顯著上調。研究發(fā)現miR-21 ASO 轉染組MG-63

7、細胞增殖能力明顯低于對照；相反miR-21 過表達組細胞增殖能力明顯增強；miR-21ASO 轉染組MG-63細胞的凋亡較對照增加，相反miR-21 過表達組細胞凋亡減少；與對照相比，miR-21 ASO組穿膜細胞數和遷移細胞的數量顯著減少，相反的現象出現在miR-21 過表達組；而且在調控miR-21的表達時，RECK 蛋白與miR-21的表達呈明顯的負相關，此外報告基因載體證實miR-21 能直接作用于RECK3'-UTR。在體實驗

8、結果發(fā)現miR-21 ASO 抑制腫瘤細胞增殖，導致腫瘤質量較對照輕(P=0.013)，形成的體積較對照小。
　　 結論：上調 miR-21表達可促進細胞增殖，侵襲和轉移，抑制細胞凋亡；而利用miR-21 ASO 抑制miR-21表達則能抑制進細胞增殖，侵襲和轉移，促進細胞凋亡；RECK 作為miR-21的一個靶點，miR-21 能影響腫瘤細胞生物學行為也許就是通過調節(jié)RECK的表達實現的；miR-21 作為骨肉瘤一個促癌基因，