RNAi沉默Notch1、Notch2對人膠質瘤U251細胞增殖的影響及其機制.pdf

1、神經(jīng)膠質瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤，高級別膠質瘤的預后通常很差，因此，探討膠質瘤的分子機制，研究新的靶向治療手段就顯得十分重要。Notch信號是膠質瘤發(fā)病機制的新研究靶點。為深入了解Notch信號通路在神經(jīng)膠質瘤發(fā)生中的作用，探討沉默Notch治療神經(jīng)膠質瘤這一可能的基因治療方法，本研究利用Notch1-shRNA慢病毒感染人膠質瘤U251細胞，篩選獲得Notch1基因穩(wěn)定沉默的膠質瘤細胞單克隆，對其體內(nèi)外增殖能力進行研究，并采用基因表達譜芯

2、片技術，分析沉默Notch1對膠質瘤U251細胞的基因表達譜的影響。此外，本研究合成了Notch2的特異siRNA序列，并采用慢病毒介導的RNAi技術研究Notch2基因沉默對膠質瘤U251細胞的體外增殖能力影響，以比較Notch1與Notch2在膠質瘤中功能的異同點。
　　 第一部分采用實時定量PCR篩選有效的Notch2 siRNA序列，構建Notch2-shRNA慢病毒載體，進行病毒包裝，結果成功包裝出表達Notch2-s

3、hRNA和陰性對照shRNA的慢病毒，滴度分別為3.7×105TU/ml和2.5×105TU/ml。
　　 第二部分采用本實驗室原有的Notch1-shRNA慢病毒和第一部分生產(chǎn)的Notch2-shRNA慢病毒感染人膠質瘤U251細胞，篩選穩(wěn)定低表達Notch1和Notch2的細胞單克隆，實時定量PCR檢測Notch1和Notch2 mRNA的表達，Western-blot法檢測細胞Notch1和Notch2蛋白的表達；結果成功

4、篩選得到Notch1和Notch2穩(wěn)定沉默的U251細胞單克隆。
　　 第三部分采用CCK-8法測定細胞生長；平板克隆形成實驗和軟瓊脂克隆形成實驗檢測細胞的集落形成能力；裸鼠種植瘤模型觀察Notch1沉默對種植瘤生長的影響。結果顯示Notch1穩(wěn)定沉默組的增殖與對照組相比明顯減慢；Notch1沉默組的平板克隆形成率為(18.6±2.5)％，低于對照組(37.0±3.3)％；Notch1沉默組軟瓊脂集落形成率(51±5)％，低于對

5、照組(80±4)％；Notch1沉默組裸鼠腋下種植瘤生長速度減慢，30天后瘤重(0.31±0.09)g，明顯低于對照組(2.35±0.71)g；統(tǒng)計學分析均有顯著意義。而Notch2沉默對細胞增殖無影響。
　　 第四部分采用基因芯片技術，分析Notch1穩(wěn)定沉默對U251基因表達譜的影響。結果顯示Notch1穩(wěn)定沉默細胞與對照細胞間的差異表達基因共有775個，涉及細胞增殖與分化、細胞周期、細胞通訊與粘附、糖脂代謝、MAPK信號轉