Toll樣受體4介導角膜棘阿米巴感染炎癥反應及低氧對其的調(diào)控作用研究.pdf

1、研究背景：
　　 棘阿米巴角膜炎(Acanthamoebakeratitis，AK)是棘阿米巴原蟲感染角膜引起的一種嚴重的致盲性眼病。近年來，隨著角膜接觸鏡的廣泛使用，其發(fā)病率迅速升高。AK的發(fā)病與角膜創(chuàng)傷、接觸污水源、配戴角膜接觸鏡明顯相關，其中配戴角膜接觸鏡是其最主要的危險因素。研究報道，每百萬個角膜接觸鏡配戴者中，AK的罹患者美國為1.36人，荷蘭為3.06人，英國為17.53-21.14人;在我國報道的第一例AK是由角膜

2、接觸鏡引起，并且與接觸鏡相關性AK，約占AK患者的30.8％。由于棘阿米巴包囊具有很強的環(huán)境適應性、抗藥性并能長期緩慢在角膜生長，導致該病藥物治療效果差、術后易復發(fā)，使AK成為臨床上治療非常棘手、具有較高致盲率的角膜感染。因此，認識角膜感染發(fā)病機制和揭示宿主抗棘阿米巴感染的免疫防御機制具有至關重要的意義。
　　 角膜上皮細胞是角膜抵抗病原體感染的第一道屏障，也是角膜天然免疫防御系統(tǒng)的主要組成細胞，有賴于其模式識別受體(patte

3、rnrecognitionreceptors，PRRs)對特定病原體的快速識別，通過產(chǎn)生豐富的炎性因子、炎性介質(zhì)及抗菌肽等激活防御系統(tǒng)，清除病原。Toll樣受體(Tolllikereceptors，TLRs)是一種重要的PRR，它通過識別許多病原微生物共有的特殊結(jié)構(gòu)-病原相關分子模式（pathogenassociatedmolecularpatterns，PAMPs），激活細胞內(nèi)的信號級聯(lián)反應，誘導炎性細胞因子的生成和釋放，趨化炎性細胞

4、浸潤，啟動炎癥和免疫反應，從而在防御細菌、真菌、病毒等病原體入侵中發(fā)揮重要作用。
　　 Toll樣受體4(TLR4)是人們最早發(fā)現(xiàn)的TLR，其主要表達于免疫細胞如淋巴細胞、單核巨噬細胞等，也可以表達宿主-環(huán)境接觸處的上皮細胞如呼吸道上皮細胞和腸上皮細胞等。TLR4識別相應配體后，可通過MyD88依賴途徑或MyD88非依賴途徑，激活下游信號通路，最后活化核轉(zhuǎn)錄因子(nuclearfactorkappa-light-chain-en

5、hancerofactivatedBcells，NF-κB)、干擾素調(diào)控因子-3（interferon-regulatedfactor-3，IRF-3）等轉(zhuǎn)錄因子，誘導宿主細胞表達炎性細胞因子，誘導炎癥反應和啟動先天免疫。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在人角膜上皮細胞中TLR4為陽性表達;應用棘阿米巴原蟲刺激人角膜細胞檢測TLR1-10表達的變化，發(fā)現(xiàn)TLR4顯著升高，說明TLR4可能參與棘阿米巴角膜炎的炎癥反應。
　　 眾所周知，氧是人

6、體新陳代謝和生命活動的關鍵物質(zhì)，同時組織氧分壓的變化也是重要的環(huán)境信號，參與機體的許多生理和病理過程如炎癥、感染、缺氧等。角膜代謝所需要的氧80％來自外界空氣，接觸鏡附著于角膜表面，使角膜處于低氧環(huán)境，從而影響角膜上皮細胞的生物特性，如上皮細胞水腫、凋亡、壞死、脫落等，破壞上皮屏障功能，降低上皮細胞的天然防御功能。研究發(fā)現(xiàn)低氧可促進綠膿桿菌對角膜上皮細胞的粘附、減少上皮細胞增殖、加速細胞凋亡，增加角膜上皮細胞對綠膿桿菌的易感性。近年研究

7、發(fā)現(xiàn)低氧能夠調(diào)控TLR4基因的表達，但因細胞類型和低氧培養(yǎng)條件的不同，低氧對TLR4的調(diào)控作用有所差異，然而低氧對人角膜上皮細胞TLR4的調(diào)控研究，目前尚未見相關報道。既然TLR4參與棘阿米巴角膜炎的炎癥過程，因此有必要對低氧是否調(diào)控人角膜上皮細胞TLR4及其信號通路、低氧是否通過調(diào)控TLR4而影響角膜上皮細胞對棘阿米巴的易感性進行深入研究，這將為有效地預防角膜棘阿米巴感染提供新的思路。
　　 本研究分為兩個部分:一、應用棘阿米

8、巴刺激人角膜上皮細胞，檢測TLR4基因與炎性因子白介素6(interleukin-6，IL-6)和IL-8分泌的變化，并應用RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術沉默TLR4基因的表達，檢測抑制TLR4后對炎性因子表達的影響，探討TLR4在人角膜上皮細胞對棘阿米巴刺激的天然免疫反應中的作用。二、通過檢測低氧對棘阿米巴刺激角膜細胞誘導的TLR4基因，下游信號通路蛋白髓樣分化因子88(myeloiddifferentia

9、tionprimaryresponsegene88，MyD88)、NF-κB和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellularsignalregulatedproteinkinase1/2，ERK1/2)，以及炎性因子IL-8和干擾素-β（interferon-β，IFN-β）表達的影響，探討低氧是否通過調(diào)控人角膜上皮細胞TLR4及其信號通路，從而影響角膜棘阿米巴感染的炎癥反應，分析低氧對棘阿米巴角膜炎易感性的影響，揭示角膜接觸鏡配

10、戴易患棘阿米巴角膜炎的原因，這將為棘阿米巴角膜炎的合理預防和治療策略提供理論依據(jù)。
　　 第一部分，Toll樣受體4介導人角膜上皮細胞對棘阿米巴的天然免疫反應
　　 目的:
　　 研究Toll樣受體4在人角膜上皮細胞對棘阿米巴炎性反應中的作用。
　　 方法:
　　 1.培養(yǎng)永生化的人角膜上皮細胞(telomerase-immortalizedhumanepithelialcells，THCEs)和

11、棘阿米巴蟲株。先用不同濃度(1×103/ml、1×104/ml、1×105/ml、1×106/ml)的棘阿米巴刺激THCEs30min，孵育12h后收集細胞，RealTime-PCR檢測TLR4mRNA的表達，Westernblot檢測TLR4蛋白表達。用1×106/ml濃度棘阿米巴刺激THCEs，于刺激的不同時間點(1h、3h、6h、12h)收集的細胞分別采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-timequantitativepoly

12、merasechainreaction，Real-timePCR)和Westernblot檢測TLR4mRNA和蛋白表達;收集的培養(yǎng)上清采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測炎性細胞因子IL-6和IL-8水平。
　　 2.設計、合成特異性針對TLR4基因的小干擾RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)序列:正義鏈為5’-GGCAAUUCUUUC

13、CAGGAAATT-3’;反義鏈為5’-UUUCCUGGAAAGAAUUGCCAG-3’。陰性對照選擇與人類基因沒有任何同源的干擾序列，正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’;反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。采用脂質(zhì)體(Lipofectamine)2000介導TLR4-siRNA及陰性對照siRNA(NC-siRNA)轉(zhuǎn)染THCEs48h后，利用Real-timePCR和Weste

14、rnblot檢測TLR4的mRNA和蛋白表達以評價抑制效果。利用棘阿米巴(1×106/ml)分別刺激轉(zhuǎn)染TLR4-siRNA及NC-siRNA的THCEs30min，孵育12h后利用ELISA檢測上清中細胞因子IL-6和IL-8的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.隨著棘阿米巴刺激濃度的增加，人角膜上皮細胞TLR4的mRNA和蛋白表達逐漸升高;在1×106/ml的棘阿米巴刺激濃度下，人角膜上皮細胞TLR4mRNA和蛋白表達在

15、刺激后6h開始升高，并以時間依賴方式呈現(xiàn)上調(diào)。棘阿米巴刺激人角膜上皮細胞6h后，IL-6和IL-8的分泌明顯升高，隨著刺激時間的延長進一步上調(diào)。
　　 2.TLR4-siRNA轉(zhuǎn)染人角膜上皮細胞后，TLR4mRNA及蛋白水平表達均受到顯著抑制。棘阿米巴刺激后TLR4-siRNA處理組IL-6和IL-8的分泌水平較NC-siRNA組顯著降低。
　　 結(jié)論:
　　 TLR4是人角膜上皮細胞識別棘阿米巴的重要受體并介導

16、炎性細胞因子IL-6和IL-8的的表達，TLR4-siRNA可通過下調(diào)炎性因子的分泌達到抑制棘阿米巴角膜炎炎癥反應的目的，為探索治療角膜棘阿米巴感染的新方法提供了理論依據(jù)。
　　 第二部分，低氧抑制Toll樣受體4介導的人角膜上皮細胞對棘阿米巴的天然免疫反應
　　 目的:
　　 研究低氧對TLR4介導的人角膜上皮細胞對棘阿米巴炎性反應的調(diào)控作用。
　　 方法:
　　 1.培養(yǎng)永生化人角膜上皮細胞(

17、THCEs)和棘阿米巴蟲株。THCEs分別置于常氧(21％O2)和低氧(1％O2)條件下37℃培養(yǎng)24h，設置空白對照組和棘阿米巴刺激組(1×106/ml)。采用AnnexinV-PE與7-AAD雙染法檢測細胞的生存活性。
　　 2.在常氧條件下，用棘阿米巴原蟲(1×106/ml)刺激已預先在低氧孵箱培養(yǎng)24h的THCEs30min后，再放入低氧孵箱孵育6h。收取的細胞利用Real-timePCR檢測TLR4、MyD88、IL-

18、8和IFN-βmRNA的表達;利用Westernblot檢測TLR4、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）的蛋白表達。收取的上清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測炎性細胞因子IL-8和IFN-β的分泌。
　　 3.在低氧條件下孵育THCEs，于不同的時間點(0h、6h、12h、24h、48h)收集細胞，分別采用Real-timePCR

19、和Westernblot檢測TLR4mRNA和蛋白表達。
　　 4.將THCEs在低氧環(huán)境中孵育24h后，用TLR4的公認配體脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）(1μg/ml)刺激6h。收取的細胞利用Real-timePCR檢測MyD88、IL-6、和IL-8mRNA的表達;利用Westernblot檢測IκBα和p-IκBα的蛋白表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.流式細胞技術分析細胞生存活性，

20、顯示低氧和棘阿米巴刺激對THCEs的生存活性均無顯著影響。
　　 2.Real-timePCR結(jié)果顯示，低氧可以下調(diào)棘阿米巴刺激THCEs引起的TLR4和通路分子MyD88的mRNA表達;Westernblot結(jié)果顯示，低氧可以降低棘阿米巴刺激THCEs引起的TLR4、p-IκBα和p-ERK1/2的蛋白表達，明顯升高IκBα的表達;ELISA結(jié)果顯示，低氧可以抑制棘阿米巴誘導的炎性細胞因子IL-8和IFN-β的分泌。
　

21、　 3.Real-timePCR和Westernblot的結(jié)果顯示，低氧分別孵育THCEs24h和48h小時后，TLR4的mRNA和蛋白水平均明顯減低。
　　 4.LPS刺激試驗結(jié)果顯示，低氧可以降低MyD88mRNA的表達，抑制IκBα的磷酸化，下調(diào)炎性細胞因子IL-6和IL-8的分泌。
　　 結(jié)論:
　　 低氧通過抑制TLR4的表達及其信號通路的活化，從而抑制人角膜上皮細胞對棘阿米巴刺激引起的炎性反應。低氧