低劑量BDE-209單獨和與BDE-47聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)海馬神經干細胞形態(tài)學及蛋白質組學的影響.pdf

1、【背景】
　　1.多溴聯(lián)苯醚（Polybrominated Diphenyl Ethers，PBDEs）
　　多溴聯(lián)苯醚(Polybrominated Diphenyl Ethers，PBDEs)是一類溴代化合物，由于阻燃效率高、成本較低常作為阻燃劑添加到樹脂、油漆、聚氨酯泡沫和聚苯乙烯等高分子合成材料中，廣泛地應用于紡織品、塑料制品、電子電器和建筑材料等領域。早在1960年開始生產和使用多溴聯(lián)苯醚，直到1981年瑞典發(fā)現多

2、溴聯(lián)苯醚是一種環(huán)境污染物。多溴聯(lián)苯醚現已成為全球環(huán)境中普遍存在的污染物。有資料顯示,大概80％的電子洋垃圾被運送到中國、印度等亞洲國家，而運送到中國的就占了90%。
　　由于多溴聯(lián)苯醚和多氯聯(lián)苯醚（PCBs）具有相似的特征：難降解性、環(huán)境穩(wěn)定性、高脂溶性、遠距離遷移性和生物放大效應，能通過食物鏈傳播，通過食物、大氣、母乳和室內灰塵等在人體內蓄積，最終可危害人類的健康。PBDEs作用的主要靶器官是神經系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、脂肪組織和甲狀腺

3、等。動物實驗證實多溴聯(lián)苯醚有神經發(fā)育毒性、生殖毒性、免疫毒性和內分泌干擾毒性及潛在的致癌性。因此,在歐美等國家已限制生產和使用低溴類PBDEs，但一些高溴類PBDEs，如BDE-209因其阻燃性好，生物毒性不確切而仍被廣泛使用。目前人們對PBDEs毒性的了解還遠不如PCBs。實驗室研究證據積累相對較多，而人群研究的對象主要是職業(yè)人群，數據相對缺乏。職業(yè)不同的人群中PBDEs同系物的分布也不相同。對中國、荷蘭、美國及瑞士人群調查發(fā)現，非職

4、業(yè)暴露人群體內主要為BDE-153，職業(yè)暴露人群體內主要為BDE-209和BDE-183。在現實環(huán)境中，多種污染物是同時存在，同時起作用。
　　2.十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）及四溴聯(lián)苯醚（BDE-47）
　　十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）是一種含有十個溴原子的多溴聯(lián)苯醚，具有穩(wěn)定性好，添加量少，價格便宜等優(yōu)勢，我國不僅是PBDEs的生產、使用和出口大國，而且還是接收電子垃圾的大國，其中BDE-209的生產使用量最大，因此BD

5、E-209已成為我國重要的環(huán)境污染物。BDE-209在生產、使用和廢物處理過程中通過一系列遷移轉化進入沉積物、大氣、生物固體及生物體中。進入生物體后，十溴聯(lián)苯醚可代謝為低溴聯(lián)苯醚、多溴二苯并呋喃及溴二苯并二噁英，引起更強的毒性效應。研究證明BDE-209具有神經發(fā)育毒性、肝臟毒性、甲狀腺毒性、生殖毒性以及致癌性；母體內的BDE-209也可通過胎盤及乳汁傳遞給胎兒。但也有學者認為BDE-209在體內的代謝快，蓄積低，在常規(guī)暴露水平下對機體

6、不造成影響。鑒于此，對于BDE-209的生物毒性的進一步研究是很有必要的。
　　四溴聯(lián)苯醚（BDE-47）也是PBDEs的主要同系物之一，與BDE-209同是近年環(huán)境中含量增長較快的持久性環(huán)境有機污染物。有研究報道示珠三角土壤中PBDEs污染嚴重，含量較高主要是BDE-209，BDE-47次之。由于BDE-209作為高溴化合物在體內代謝時可轉化為BDE-47，轉化過程中二者比例可發(fā)生不同變化。也有研究發(fā)現，BDE-209的作業(yè)人群

7、體內存在高含量的BDE-209和相對較低含量BDE-47，停止暴露三年后，血樣本中BDE-209的含量顯著下降，但BDE-47含量并未發(fā)生明顯改變，這一變化對生物體影響正是我們要關注的焦點。因此，開展BDE-209與BDE-47聯(lián)合暴露對生物體影響的研究十分必要。
　　3.神經干細胞(neural stem cell，NSCs)
　　神經干細胞(NSCs)是干細胞的一種，是存在于腦和脊髓中未分化的細胞，與其他干細胞一樣，神經

8、干細胞也具有自我更新、分裂增殖及多樣分化的特點，它能夠分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞等多種類型的神經細胞，屬于專能干細胞。神經干細胞的發(fā)現，為中樞神經性的重建和神經的再生提供了一個新的思路，為學習記憶機制的研究提供了一個新的視點。在哺乳動物胚胎期，神經干細胞主要分布在海馬、嗅球、小腦、大腦皮質、腦室下區(qū)和側腦室(室管膜上皮)；在成年后主要存在于海馬、紋狀體、腦室區(qū)、腦室下區(qū)及嗅球等部位。目前，NSCs研究的核心問題是NSCs增

9、殖和分化的調控，研究表明，NSCs的增殖及分化的調控受多種因素的影響，有外源性因素(細胞因子和微環(huán)境)和內源性因素(基因)共同調控，其中起著決定作用的是內源性因素。
　　個體發(fā)育是由干細胞不斷分化形成功能細胞的過程，而神經系統(tǒng)發(fā)育也是胚胎干細胞不斷分化成神經干細胞、再分化成神經細胞的過程，這分化過程任何一環(huán)節(jié)受影響均可導致神經元數目減少，從而引起神經功能缺陷。腦是由神經干細胞經過不斷增殖、分化而最終形成。神經干細胞通過對稱分裂進行

10、自我更新，維持細胞種群，通過不對稱分裂完成細胞分化，而外來化學物能夠影響神經干細胞的自我更新潛能和發(fā)育分化的方向選擇。
　　4.蛋白質組學（Proteomics）
　　蛋白質組(Proteome)是指一種細胞或一個組織基因組所表達的全部蛋白質。蛋白質組學（Proteomics）是以基因組編碼的所有蛋白質為研究對象，從細胞水平及整體水平研究蛋白質的組成及其變化規(guī)律，從而深入認識有機體的多種病理生理過程。蛋白質組學一詞源于蛋白質

11、（protein）與基因組學（genomics）兩個詞的組合，意指“一種基因組所表達的全套蛋白質”，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質。蛋白質組本質上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質的特征，包括蛋白質的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質水平上的關于疾病發(fā)生，細胞代謝等過程的整體而全面的認識，這個概念最早是由Marc Wilkins在1995年提出的。因此，蛋白質組學研究不僅是探索生命奧秘的必須工作，也能

12、為人類健康事業(yè)帶來巨大的利益。蛋白質組學的研究是生命進入后基因時代的特征。
　　由于NSCs分化過程中有眾多的蛋白質、細胞因子的參與和消失,探索其功能和機制的過程是極其復雜和龐大的,而蛋白質組學具有規(guī)模大和高通量等優(yōu)點,與基因組學、生物信息學互相滲透、互相補充。PBDEs可影響NSCs的增殖和分化，但是其影響機制尚未完全闡明，因而本課題從細胞水平,給予體外培養(yǎng)神經干細胞低劑量BDE-209及BDE-47聯(lián)合暴露，研究BDE-209

13、及BDE-47聯(lián)合暴露對神經干細形態(tài)學及蛋白質組學的影響，以更全面地了解BDE-209及BDE-47神經發(fā)育毒性的影響關鍵點，更深入地了解PBDEs與先天神經發(fā)育異常的關系，為臨床上對PBDEs引起的神經發(fā)育異常進行有效地檢測和預防提供理論依據。本課題分為以下兩個部分進行各項具體實驗。
　　第一部分低劑量BDE-209單獨和與BDE-47聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)神經干細胞的形態(tài)學的影響
　　【目的】
　　取24小時內新生SD

14、大鼠的海馬組織進行無血清傳代培養(yǎng)，對神經干細胞進行鑒定和純度檢測，染毒后分別測量形成神經球數目及神經球直徑，觀察BDE-209單獨和與BDE-47聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經干細胞形態(tài)的影響。
　　【材料與方法】
　　1.購買清潔級24小時內新生SD大鼠，取大鼠海馬組織進行體外神經干細胞的培養(yǎng)。
　　2.對培養(yǎng)3-4代后的海馬神經干細胞進行鑒定及純度檢測。
　　3.將傳代培養(yǎng)3-4代的新生鼠海馬神經干細胞吹打

15、成單細胞懸液，之后進行BDE-209及BDE-47染毒，實驗共分8組：對照組（DMSO），0.6 ug/ml BDE-209組，1.0 ug/ml BDE-209組，6.0 ug/ml BDE-209組，3.2ug/ml BDE-47組，0.6ug/ml BDE-209+3.2ug/ml BDE-47組，1.0ug/ml BDE-209+3.2ug/ml BDE-47組，6.0ug/ml BDE-209+3.2ug/ml BDE-47組

16、，每組設5個平行樣。對照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。
　　4.染毒72h后，在倒置顯微鏡下進行神經干細胞形態(tài)觀察，利用圖象分析軟件記錄形成神經球的個數，測量神經球的平均直徑。
　　【結果】
　　1.神經干細胞鑒定：海馬組織經培養(yǎng)3～5天可見神經球形成,之后可見神經球逐漸增大，經免疫細胞化學染色，神經干細胞的標記性蛋白巢蛋白(Nestin)表達陽性，證實所分離培養(yǎng)的細胞是神經干細胞。
　　2.海馬神經干細胞培養(yǎng)3

17、～4代后在倒置顯微鏡下觀察，由數十到數百個細胞聚集形成大小不等的神經球，表面可見單細胞突出呈魚泡狀，折光性強，周圍光暈明顯，吹打成單細胞懸液后行免疫細胞化學法對神經干細胞的純度進行檢測。由結果可見分散的神經干細胞占主體,可占90%以上。
　　3.利用圖象分析軟件記錄形成神經球的個數，測量神經球的平均直徑，發(fā)現低劑量BDE-209染毒組(0.6 ug/ml BDE-209組)形成神經球個數與對照組無顯著差異。隨著染毒劑量的增加，神經

18、球數目變少。還發(fā)現低劑量BDE-209染毒組(0.6 ug/ml BDE-209組和1.0 ug/ml BDE-209)形成神經球直徑大小與對照組無顯著差異。BDE-209和BDE-47聯(lián)合染毒對形成神經球個數的影響存在交互作用(P<0．05)。
　　【結論】
　　以上提示：無血清培養(yǎng)的新生鼠海馬組織神經干細胞具有自我更新和增殖能力，神經干細胞形成懸浮生長的神經球，經免疫細胞化學鑒定所培養(yǎng)的是神經干細胞。一定劑量的BDE-2

19、09和BDE-47可導致新生鼠海馬神經干細胞形成神經球數目及直徑改變，BDE-209與BDE-47之間對神經干細胞的生長存在一定的交互作用。
　　第二部分低劑量BDE-209單獨和與BDE-47聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)神經干細胞蛋白組學的影響
　　【目的】
　　采用蛋白質組學研究BDE-209及BDE-47對神經干細胞蛋白的影響，從蛋白質水平探討PBDES神經發(fā)育毒性機制。
　　【材料與方法】
　　1.傳代培養(yǎng)3

20、-4代的新生鼠海馬神經干細胞暴露于BDE-209及BDE-47，實驗共分4組：（1）對照組（DMSO）；（2）6.0 ug/ml BDE-209組；（3）3.2 ug/mlBDE-47組；（4）6.0 ug/ml BDE-209+3.2 ug/mlBDE-47組。每組設5個平行樣。對照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。
　　2.染毒培養(yǎng)72h后，離心收集細胞，提取各組總蛋白質，采用Bradford法測定蛋白質樣品濃度。
　　3.

21、進行雙向凝膠電泳（2-DE）分離差異蛋白：第一向等電聚焦（IEF）；第二向SDS-PAGE.
　　4.凝膠染色：分析膠銀染，質譜膠考染。
　　5.銀染后采用Powerlook1100掃描儀對染色后的雙向凝膠電泳膠進行掃描獲取圖像，采用Image Master2D platinum5.0凝膠圖像分析軟件進行分析識別差異表達的蛋白質點。
　　6.對表達差異1.8倍以上蛋白質點進行膠內酶解和MALDI-TOF-MS檢測，獲得