

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領
文檔簡介
1、目的:
1.檢測人巨絀胞病毒(human cytomegalo virus,HCMV)基因在人胚胎成纖維細胞(Human embryo fibroblast,HEF)和小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryo fibroblast,MEF)中的表達情況,為進一步研究HCMV種屬特異性的機制奠定分子生物學基礎。
2.觀察HCMV感染對HEF和MEF細胞自噬的影響,為HCMV種屬特異性的研究尋找新的方向和證據(jù)。
2、> 方法:
1.組織塊分離培養(yǎng)法結(jié)合膠原酶消化法分離原代HEF和MEF細胞。
2.在HEF細胞中擴增HCMV AD169毒株,空斑定量法測定病毒滴度。
3.相差顯微鏡下觀察病毒感染(MOI=5)后HEF和MEF細胞的形態(tài)學改變。
4.RT-PCR、Westem-blot、免疫熒光法檢測HCMV-IE、UL84、UL83的表達。
5.MTT比色法檢測HEF和MEF細胞的增殖活性。
3、 6.單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)染色法和透射電鏡檢測胞內(nèi)自噬體。
7.Western-blot檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達;免疫熒光法檢測LC3的表達。
結(jié)果:
1.成功分離培養(yǎng)并純化原代HEF和MEF細胞,傳代后細胞狀態(tài)良好。
2.用HCMV分別感染HEF和MEF細胞后,HEF細胞第2d逐漸變大變圓并相互融合,第4d超過80%細胞可見典型
4、的HCMV特征性病變效應(CPE),而MEF細胞在相應時間未出現(xiàn)上述的變化。
3.RT-PCR和Western-blot表明HEF細胞表達HCMV-IE1、IE2、UL84和UL83 mRNA以及其編碼的蛋白,相對表達量顯著高于正常對照組(P<0.01);而MEF細胞僅表達IE1和IE2 mRNA和蛋白,且相對表達量顯著低于HEF細胞(P<0.05)。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCMV感染HEF細胞72 h表達IE和UL83蛋白,而ME
5、F細胞則無明顯表達。
4.MTT檢測顯示HCMV感染HEF細胞24 h內(nèi),細胞增殖活性升高,24 h后隨著感染時間的延長而降低,而HCMV感染MEF細胞后,96 h內(nèi)細胞增殖活性持續(xù)升高(P<0.05)。
5.MDC染色后觀察顯示HEF和MEF細胞感染后24 h,多數(shù)核周出現(xiàn)的大量藍綠色的點狀結(jié)構(gòu),24 h后HEF細胞陽性細胞數(shù)逐漸減少,細胞內(nèi)藍綠色點狀結(jié)構(gòu)密度減弱,而MEF細胞陽性細胞數(shù)和細胞內(nèi)藍綠色點狀結(jié)構(gòu)密度仍
6、然逐漸增強,明顯高于HEF感染組。
6.透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)HCMV感染后HEF和MEF細胞漿內(nèi)均出現(xiàn)大量囊泡狀結(jié)構(gòu),高倍鏡下可見雙層膜結(jié)構(gòu),其中包含未完全降解或者已降解的細胞器等。
7.Western-blot結(jié)果顯示,HCMV感染HEF和MEF細胞后Beclin1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的相對表達量升高,顯著高于模擬感染組(P<0.01);而HEF細胞在感染24 h后逐漸降低,但高于正常對照組(P<0.01);而ME
7、F細胞24 hBeclin1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的相對表達量逐漸升高,顯著高于HEF組(P<0.05)。免疫熒光檢測LC3蛋白結(jié)果與Western-blot結(jié)果一致。
結(jié)論:
1.HCMV在MEF細胞中的復制停滯在IE2基因表達之后和UL84基因表達之前的時相,不能產(chǎn)生完整的子代病毒顆粒。推斷即刻早期蛋白在MEF細胞內(nèi)的低水平表達可能與HCMV的種屬特異性相關(guān)。
2.HCMV感染早期誘導HEF和MEF細
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 工頻磁場誘導小鼠胚胎成纖維細胞ROS相關(guān)的自噬.pdf
- 豬Nangog基因在成纖維細胞與克隆胚胎中的過表達研究.pdf
- 硫酸乙酰肝素介導的HCMV體外感染小鼠胚胎成纖維細胞的實驗研究.pdf
- CDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達及其對瘢痕疙瘩成纖維細胞影響的研究.pdf
- 細胞因子在登革病毒感染人皮膚成纖維細胞中的作用.pdf
- 肌成纖維細胞自噬趨勢對腎組織損傷的影響.pdf
- CaMKⅡ?qū)嵝菘诵∈笈咛コ衫w維細胞HSP70表達的影響.pdf
- 大蒜新素對人巨細胞病毒感染人胚肺成纖維細胞Caspase-3表達的影響.pdf
- 磷酸酶MTMR14的缺失促進小鼠胚胎成纖維細胞的自噬和增殖.pdf
- 工頻磁場對小鼠胚胎成纖維細胞周期及增殖的后續(xù)影響研究.pdf
- MBL阻遏HCMV感染人胚肺成纖維細胞的研究.pdf
- 細胞自噬在巨細胞病毒感染復制中的作用研究.pdf
- 皮膚成纖維細胞中dystrophin基因的表達研究.pdf
- 黃芩苷對大鼠肺成纖維細胞及肌成纖維細胞CTGF和α-SMA表達的影響.pdf
- 小鼠黑素瘤細胞exosomes誘導小鼠成纖維細胞侵襲能力的表達.pdf
- PiggyBac轉(zhuǎn)座子介導外源基因在豬成纖維細胞及胚胎中表達研究.pdf
- HCMVAD169突變株體外感染小鼠胚胎成纖維細胞及其基因變異的研究.pdf
- 人巨細胞病毒感染對人胚肺成纖維細胞周期及復制前復合物的影響.pdf
- 來氟米特對人巨細胞病毒感染的人胚肺成纖維細胞增殖及凋亡的影響.pdf
- ALA-紅光-PDT對成纖維細胞增殖活性及自噬的影響.pdf
評論
0/150
提交評論