模擬強日光照射對兔眼視網(wǎng)膜損傷的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、光是視覺系統(tǒng)進化和發(fā)育的動力,視網(wǎng)膜是感受外界光線形成視覺的重要組織結構,外界光線只有到達功能正常的視網(wǎng)膜才能形成視覺圖像。但是,當光線的光強度、光照時間等超過了視網(wǎng)膜的承受力,將會造成視網(wǎng)膜的光損傷。視網(wǎng)膜是視覺器官中重要組織結構,彳艮容易受到光的損傷。由于眼的屈光介質(zhì)有很強的聚焦作用,可將入射光束會聚成很小的光斑,從而使視網(wǎng)膜單位面積上接受的光能比入射到角膜的光強約105倍。早在17世紀瑞士醫(yī)生Bonetus就描述了日光引起的視力損

2、害。1966年Noell等報道,一定量的光,即使低于熱損傷的閾值,也可引起受試小鼠的視網(wǎng)膜損傷。烈日下太陽光照度可高達1300001ux以上,尤其是在高山、沙漠、海島及艦船甲板等環(huán)境中會增強光的輻射作用,強光下無特殊防護很容易發(fā)生視網(wǎng)膜光損傷。以往實驗通常采用日光燈、手術顯微鏡等較低照度的可見光,較長時間照射造成光損傷。本實驗采用光譜最接近太陽光的氙燈作為致傷光源,300001ux模擬晴天少云時的太陽光,濾光片濾掉紅外光線,不會引起明顯

3、的溫度升高,減少實驗動物的熱損傷,實驗條件接近太陽光對視網(wǎng)膜的損傷。以往對視網(wǎng)膜光損傷病理學改變的研究多集中在損傷后的早期,本實驗對光損傷后視網(wǎng)膜的病理學改變進行了較長時間的動態(tài)觀察。 目的: 本課題從組織形態(tài)等方面研究視網(wǎng)膜光損傷后感光細胞的改變特征及其發(fā)生機制。通過300001ux光照射兔眼,采用光鏡、透射電鏡與末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記(in situterminaldeoxynucleotib

4、yl transferase mediateddUTP-digoxigenin(biotin) nick end-labeling,TUNEL)技術對光損傷后視網(wǎng)膜感光細胞的病理學改變進行動態(tài)觀察,探討強日光照射對視網(wǎng)膜組織結構的影響及光損傷的致傷機理。 方法: 一、實驗動物 選取月齡相當、健康成年新西蘭白兔25只,雌雄不限,體重2~2.5kg。隨機將動物分為3組。正常對照組5只兔,15min光照組5只兔和30m

5、in光照組15只兔(分別在光照后2d、7d和14d各取5只兔進行觀察)。動物室內(nèi)相對濕度40%~60%,室內(nèi)溫度21~24℃。所有實驗用家兔均在自然明及暗各12 h的自然循環(huán)光環(huán)境下適應7d,強光照前暗適應24 h。 二、光損傷模型的建立 將實驗兔雙眼分別用復方托品酰胺散大瞳孔至8mm,將光照組兔固定(只有頭部外露),放置開瞼器使兔眼暴露在氙燈光照下,濾光片濾掉紅外光線,光源照度為300001ux。根據(jù)分組照射時間分別控

6、制在15min和30min,暗適應30min后送回動物室正常條件下飼養(yǎng),15min光照組在光照后2d取材進行觀察,30min光照組在光照后2d、7d和14d不同時間分別取材進行觀察。正常飼養(yǎng)組散瞳后不予光照,飼養(yǎng)2d后取材觀察。 三、光學顯微鏡觀察 全麻下摘取實驗動物眼球,去除眼前節(jié),放入10%福爾馬林溶液中固定48小時。自視神經(jīng)根顳側1PD處作矢狀切面取材,石蠟包埋,5μm連續(xù)切片,常規(guī)HE染色與TUNEL標記染色,光

7、學顯微鏡下觀察。 四、透射電鏡觀察 全麻下摘取實驗動物眼球,去除眼前節(jié),2,5%戊二醛固定2小時(4℃);取視神經(jīng)根顳側IPD處的視網(wǎng)膜,切成1mm×0.5mm矩形組織塊;磷酸緩沖液沖洗三次;1%鋨酸固定2小時;雙蒸水沖洗三次;梯度酒精脫水;置換2次;純樹脂包埋;修塊,半薄切片,天青-美蘭染色,光鏡下定位觀察;超薄切片,醋酸雙氧鈾,枸櫞酸鉛染色;Philips EM208s電鏡觀察 五、視網(wǎng)膜細胞凋亡檢測

8、 切片常規(guī)脫蠟水化;將一燒杯盛200ml的0.01 M、pH6.0的檸檬酸緩沖液,加熱至90~95℃,迅速放入切片,加入雙蒸水(20~25℃)80ml作迅速冷卻,將玻片移至PBS(20~25℃)洗3次;加20%正常牛血清室溫30 min;將TUNEL反應混合液加在切片上,37℃溫育90min(陰性對照片、TUNEL混合液中不加TDT); PBS洗3次;3%H2O2甲醇液室溫阻斷10min;37℃溫育90min;加POD轉(zhuǎn)化劑,37℃溫育

9、30min;PBS洗5min×3次;DAB/H2O2顯色;蘇木素淡染,常規(guī)脫水,透明,中性樹膠封固。 在TUNEL標記切片的視網(wǎng)膜后極部隨機選取5個視野,分別計數(shù)感光細胞總數(shù)及呈陽性著色的凋亡感光細胞數(shù),取其平均值并計算感光細胞凋亡率。 六、統(tǒng)計學分析: 所有實驗數(shù)據(jù)采用Excel記錄,利用SPSS13.0 for Windows統(tǒng)計學軟件對兩組均數(shù)間比較行t檢驗,以x±s表示,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義的

10、判定標準。 結果: 一、光學顯微鏡觀察 正常組視網(wǎng)膜組織未見明顯病理改變,結構清晰完整。15min光照組2d時觀察,桿體錐體層結構紊亂,界線不清;外顆粒層細胞核排列疏松紊亂,可見細胞間水腫:內(nèi)顆粒層細胞核排列疏松紊亂;神經(jīng)節(jié)細胞層偶見細胞核消失,胞漿呈空泡狀。30min光照組2d時觀察,桿體錐體層結構明顯紊亂,界線不清,可見組織斷裂;外顆粒層細胞核排列疏松紊亂,細胞間水腫明顯增多;內(nèi)顆粒層細胞核排列疏松紊亂,細胞

11、核消失,胞漿呈空泡狀;神經(jīng)節(jié)細胞層多數(shù)細胞核消失,胞漿呈空泡狀。30min光照組7d時觀察,桿體錐體層可見大部分組織斷裂崩解;外顆粒層細胞核排列疏松紊亂,部分細胞核消失,胞漿呈空泡狀;內(nèi)顆粒層細胞核排列紊亂,細胞核數(shù)量明顯減少,胞漿呈空泡狀;神經(jīng)節(jié)細胞層絕大部分細胞核消失,胞漿呈空泡狀。30min光照組14d時觀察,桿體錐體層結構比較整齊,斷裂崩解組織明顯修復;外顆粒層細胞核排列比較整齊,偶見細胞胞漿呈空泡狀;內(nèi)顆粒層細胞核排列比較整齊

12、;神經(jīng)節(jié)細胞層可見部分細胞核消失,胞漿呈空泡狀。 二、透射電鏡觀察 正常組視網(wǎng)膜結構基本正常。15min光照組2d時觀察,桿體錐體層外節(jié)膜盤結構紊亂,板層結構離散,內(nèi)節(jié)線粒體腫脹,個別嵴斷裂;外顆粒層細胞胞漿有空泡樣改變;內(nèi)顆粒層胞漿輕度腫脹;神經(jīng)節(jié)細胞層細胞形態(tài)基本正常。30min光照組2d時觀察,桿體錐體層外節(jié)膜盤結構紊亂,板層結構重度離散,內(nèi)節(jié)線粒體腫脹,嵴斷裂;外顆粒層細胞胞漿有空泡樣改變;內(nèi)顆粒層胞漿輕度腫脹;

13、神經(jīng)節(jié)細胞胞漿輕度腫脹。30min光照組7d時觀察,桿體錐體層外節(jié)膜盤組織結構紊亂,板層結構消失,空泡化,內(nèi)節(jié)線粒體腫脹,嵴斷裂;外顆粒層細胞胞質(zhì)腫脹,大量空泡樣改變,排列紊亂,部分胞膜破壞;內(nèi)顆粒層胞漿高度腫脹,呈空泡樣改變,可見部分胞膜破壞;神經(jīng)節(jié)細胞可見胞漿腫脹,胞膜破壞。30min光照組14d時觀察,桿體錐體層外節(jié)膜盤組織結構較規(guī)則,板層結構比較致密,內(nèi)節(jié)線粒體腫脹,嵴斷裂;外顆粒層細胞胞漿腫脹減輕,排列較整齊;內(nèi)顆粒層胞漿腫脹

14、減輕,排列較整齊;神經(jīng)節(jié)細胞胞漿腫脹減輕。 三、視網(wǎng)膜細胞凋亡檢測 正常組視網(wǎng)膜TUNEL染色均為陰性。光照后各組外顆粒層出現(xiàn)散在分布的陽性表達細胞,表現(xiàn)為顆粒狀黃色或棕黃色著色,定位于細胞核,部分胞核邊緣著色深,中央著色淺,呈指環(huán)狀外觀。15min光照組2d時感光細胞凋亡率為13.23%±0.86%,30min光照組2d時感光細胞凋亡率為13.26%±1.54%,30min光照組7d時感光細胞凋亡率為29.54%±1.

15、44%,30min光照組14d時感光細胞凋亡率為29.21%±0.99%。15min光照組2d時感光細胞凋亡率與30min光照組2d時感光細胞凋亡率兩者無顯著性差異(P>0.05);30min光照組2d時感光細胞凋亡率與30min光照組7d時以及30min光照組14d時比較均具有顯著性差異(P<0.05);30min光照組7d時感光細胞凋亡率與30min光照組14d時感光細胞凋亡率兩者無顯著性差異(P>0.05)。 結論:

16、 一、本實驗采用光譜最接近太陽光的氙燈作為致傷光源,300001ux模擬晴天少云時的太陽光,濾光片濾掉紅外光線,不會引起明顯的溫度升高,減少實驗動物的熱損傷,實驗條件接近太陽光對視網(wǎng)膜的損傷,成功構建太陽光視網(wǎng)膜損傷模型。 二、本實驗發(fā)現(xiàn)300001ux模擬日光照射白兔眼15min光照組2d時就發(fā)現(xiàn)對視網(wǎng)膜造成光損傷。本實驗發(fā)現(xiàn)300001ux模擬日光照射白兔眼15min,2d后可觀察到視網(wǎng)膜的光損傷病理改變。證實短時間強光照

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