探針熔解曲線分析應用于丙型肝炎病毒的基因分型.pdf

1、病毒基因型是丙型肝炎抗病毒治療方案選擇的重要依據(jù),常見的分型方法有測序分析、反向線性雜交、實時熒光PCR等,不同的方法設計各有優(yōu)勢和不足,本文建立了一個熒光PCR結合熔解曲線分析的丙型肝炎病毒(Hepatitis CvirUS,HCV)分型體系,用以區(qū)分中國大陸較常見的HCV1a、1b、2a、3a、3b、6a亞型。
　　 實驗方法如下:
　　 一、制備6個內含HCV RNA核心區(qū)核酸序列的病毒樣顆粒(HCV假病毒),分別

2、作為6個HCV亞型的替代物/陽性質控品;
　　 二、設計通用引物擴增出HCV基因組的核心區(qū),并設計熒光探針與各HCV亞型擴增子雜交,使之得到亞型特異的熔點;
　　 三、考察和優(yōu)化體系的分型能力;
　　 四、建立從RNA提取到PCR產(chǎn)物分析的檢測流程,進行標本檢測。
　　 實驗結果:
　　 一、制各的6個HCV假病毒分別包裹了6個HCV亞型基因組核心區(qū)序列,且耐受核酸酶降解;
　　 二、通用

3、引物可成功擴增出6個HCV亞型基因組核心區(qū)序列,設計的兩條熒光探針與各亞型序列雜交,可得到亞型特異的熔點,從而能夠準確區(qū)分6個HCV亞型(在探針檢測區(qū)有突變的病毒株除外);
　　 三、分型體系的檢測靈敏度1a、1b、2a、3b和6a達到50拷貝RNA,3a達到500拷貝RNA,對于1b和2a亞型雙重感染,當兩者RNA比例在1:95到95:1之間時可以檢出;
　　 四、用本方法檢測由假病毒摻入陰性血清制成的模擬樣本,1a、