微生物發(fā)酵制備2，3-丁二醇及其雙水相萃取.pdf

1、2，3-丁二醇(2，3-Butanediol)是一種重要的化工原料和液體燃料，被廣泛應用于化工、食品、醫(yī)藥、燃料及航空航天等多個領域，其生產(chǎn)方法主要為生物轉化法。目前生物轉化法生產(chǎn)2，3-丁二醇大多用葡萄糖作為碳源，而葡萄糖的價格較高，且存在與人爭糧、與糧爭地的問題。此外，由于2，3-丁二醇具有較強的親水性和較高的沸點，且發(fā)酵液成分復雜，因而該產(chǎn)品下游分離比較困難。原料成本高、產(chǎn)品分離困難已經(jīng)成為2，3-丁二醇大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸。針

2、對這些問題，本論文研究了生物轉化法生產(chǎn)2，3-丁二醇的工藝，并采用新型雙水相體系對發(fā)酵液中的2，3-丁二醇進行分離萃取，最后考察了利用廉價的非糧原料菊芋作為底物發(fā)酵2，3-丁二醇的可行性。 首先，以KlebsiellapneumoniaeDSM2026為菌種，通過批式發(fā)酵實驗，確定了生物轉化法生產(chǎn)2，3-丁二醇的最適條件為：初始底物濃度8％，徼氧發(fā)酵，通氣量為0.04vvm，pH值為5.5。在該條件下進行批式流加發(fā)酵，可以獲得目

3、標產(chǎn)物濃度為42.60g/L，生產(chǎn)強度為0.76g/(L·h)，葡萄糖的質(zhì)量轉化率為23％。在此基礎上.考察了微氧條件下K.pneumoniaeDSM2026在連續(xù)發(fā)酵中的動態(tài)行為，結果表明，較大程度地擾動底物濃度并不能誘發(fā)長周期振蕩現(xiàn)象的產(chǎn)生，但卻在底物濃度沒有擾動情況下出現(xiàn)了CO2短周期振蕩現(xiàn)象，且僅當稀釋速率在0.20～0.25h-1范圍內(nèi)才能出現(xiàn)這種振蕩，振蕩周期為9.3～15.0min。 其次，以K.pneumonia

4、eCICC10011為菌種，通過批式發(fā)酵實驗，確定了生物轉化法生產(chǎn)2，3-丁二醇的最適通氣量為0.10vvm，最適pH為5.8。在該條件下進行批式流加發(fā)酵，可以獲得目標產(chǎn)物濃度為85.61g/L，生產(chǎn)強度為1.53g/(L·h)，葡萄糖的質(zhì)量轉化率為45％。 通過對批式流加發(fā)酵過程中兩株克雷伯氏菌代謝流量的分析表明，K.pneumoniaeCICC10011代謝產(chǎn)生的各種有機酸和乙醇濃度均明顯低于K.pneumoniaeDSM2

5、026，而目標產(chǎn)物濃度以及產(chǎn)物轉化率卻相對較高，是發(fā)酵2，3-丁二醇的優(yōu)良菌株。 再次，對新型雙水相分離體系—異丙醇/硫酸銨體系從發(fā)酵液中萃取分離2，3-丁二醇進行了研究。結果表明，目標產(chǎn)物2，3-丁二醇和乙偶姻主要富集在上相中，而葡萄糖主要富集在下相中；當異丙醇和硫酸銨的質(zhì)量濃度分別是34％和20％時，2，3-丁二醇和乙偶姻的分配系數(shù)分別為8.29和8.98，回收率分別達到91％和92％；采用該條件對發(fā)酵液直接進行萃取，細胞的

6、去除率在99％以上，可溶性蛋白去除率可達85％。雙水相萃取2，3-丁二醇除去了部分水和一些大分子物質(zhì)，將固液分離和濃縮兩步集成化，降低了后續(xù)蒸餾時的粘度，極大地簡化了分離工藝。而且經(jīng)過雙水相萃取后所得的菌體，可以直接作為下一批發(fā)酵的種子繼續(xù)使用。細胞循環(huán)發(fā)酵可以減少種子培養(yǎng)步驟，節(jié)約發(fā)酵時間。 最后，探索了利用非糧廉價的菊芋為原料生物轉化法生產(chǎn)2，3-丁二醇的可行性。通過搖瓶發(fā)酵實驗考察了不同底物、不同水解方式以及微量元素對發(fā)酵

7、的影響，結果表明，菊芋是良好的發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的底物，采用酸水解或酶水解兩種方式制得的糖液發(fā)酵效果基本一致，菊芋中含有的微量元素完全能夠滿足發(fā)酵的需要，發(fā)酵過程中無需添加微量元素。在此基礎上，在5L發(fā)酵罐中分別采用分步糖化發(fā)酵和同步糖化發(fā)酵兩種工藝發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇，結果表明，同步糖化發(fā)酵不但省去了單獨糖化步驟，而且還提高了產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)效率，采用批式流加發(fā)酵方式，發(fā)酵40h，目標產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)強度分別達到91.63g/L和2