ARO9、ARO10基因過量表達對Saccharomyces cerevisiae產(chǎn)3-甲硫基丙醇代謝調(diào)控的影響.pdf

1、3-甲硫基丙醇是我國芝麻香型白酒的特征性香物質，也是多種食品的重要香氣組分，天然存在于葡萄酒、啤酒、醬油、奶酪、番茄和土豆中。3-甲硫基丙醇的香氣閾值低，在食品中建議用量為0.1-10mg/kg，其風味依次呈現(xiàn)麥芽香味、香油味和熟土豆味。本文擬通過構建釀酒酵母菌株代謝網(wǎng)絡，進行代謝通量分析預測目標基因，采用基因工程手段改造菌種并進行發(fā)酵驗證，為獲得高產(chǎn)3-甲硫基丙醇的基因工程菌株奠定基礎。通過研究，主要得到以下結果：
　　1.在營

2、養(yǎng)缺陷型釀酒酵母INVSc1中，過量表達轉氨酶(EC2.6.1.58)基因ARO9，分析發(fā)酵液中3-甲硫基丙醇的產(chǎn)量是否提高來驗證克隆基因的功能。將ARO9基因與穿梭質粒pYES2連接，構建釀酒酵母表達質粒pYES2-ARO9，經(jīng)測序驗證后，使用醋酸鋰方法轉化釀酒酵母菌株INVSc1中進行表達，驗證ARO9基因過量表達對發(fā)酵產(chǎn)物3-甲硫基丙醇影響。結果表明，構建的釀酒酵母轉化子SC09-1發(fā)酵120h時，其生成量比未導入的對照菌株，其3

3、-甲硫基丙醇產(chǎn)量提高16.1％。因此，S.cerevisiaeS288C中轉氨酶(EC2.6.1.58)是3-甲硫基丙醇生物合成途徑的關鍵限速酶，其增強轉氨酶基因ARO9的克隆及基因表達，有利于提高3-甲硫基丙醇的合成代謝流量。
　　同理，將脫羧酶基因ARO10與穿梭質粒pYES2連接，構建了釀酒酵母表達質粒pYES2-ARO10。經(jīng)測序驗證后，使用醋酸鋰方法轉化到INVSc1中進行表達，對發(fā)酵產(chǎn)物進行檢測，結果表明，構建的釀酒酵

4、母轉化子SC10-1能夠過量生產(chǎn)3-甲硫基丙醇，發(fā)酵120h時，其生成量比未導入的對照菌株，其3-甲硫基丙醇產(chǎn)量提高55.2%。因此，S.cerevisiaeS288C中脫羧酶(EC4.1.1.72)是3-甲硫基丙醇生物合成途徑的關鍵限速酶之一，過表達脫羧酶基因ARO10，有利于提高3-甲硫基丙醇的合成代謝流量。
　　2.在原養(yǎng)型釀酒酵母S288C中，分別過表達轉氨酶基因（ARO9）和脫羧酶基因（ARO10），獲得相應轉化子GSO

5、9和GSO10；并對已構建成功的基因工程菌株GSO9、工程菌株GSO10和宿主菌S288C進行搖瓶發(fā)酵實驗。
　　發(fā)酵結果表明：當發(fā)酵85h時，工程菌株GSO9的3-甲硫基丙醇生成量基本穩(wěn)定，最大生成量為1.07g/L，對照菌株S288C中3-甲硫基丙醇的最大生成量0.97g/L，工程菌株GSO9發(fā)酵過程中，3-甲硫基丙醇的生成量比對照菌株S288C提高10.3%。當發(fā)酵95h時，工程菌株GSO10的最大生成量為1.23g/L，對

6、照菌株S288C中3-甲硫基丙醇的最大生成量1.02g/L，在工程菌株GSO10發(fā)酵過程中，3-甲硫基丙醇的生成量比對照菌株S288C提高20.6%。上述研究為進一步高產(chǎn)3-甲硫基丙醇的釀酒酵母基因工程菌株的代謝通量分析提供材料和根據(jù)。
　　3.基于構建的代謝網(wǎng)絡，對釀酒酵母S288C和兩株過表達工程菌株GSO9和GSO10，進行了代謝通量分析，研究了分別過表達釀酒酵母自身的轉氨酶（EC2.6.1.58）和脫羧酶（EC4.1.1.